耐盐大豆培育分子策略的探讨

论文摘要

大豆是主要的油料作物之一,而土壤盐渍化和线虫病严重抑制了大豆的生长和发育,因此,培育耐盐抗线虫大豆新品种对提高大豆产量无疑将产生重要影响。本文的目的是利用农杆菌介导的大豆胚尖高效遗传转化方法,将分别来自三种耐盐性不同的植物的与阴离子清除有关的甲基转移酶基因导入大豆中,以期为植物基因工程探索出一条新途径,同时为大豆的遗传育种提供新资料。对大豆的灭菌方法、外植体的优化、分化和拔高培养基的优化、生根培养基及生根方法等进行了探索,以建立大豆胚尖高效再生体系;对大豆遗传转化过程中的重要因素如筛选压、菌液浓度、浸染时间、农杆菌抑制剂的使用等进行了研究;分别将来自拟南芥、盐芥和盐地碱蓬的甲基转移酶基因MCT利用农杆菌介导的方法导入大豆中,并利用PCR、RT-PCR、Southern杂交等分子手段对转化子进行了检测。建立了大豆胚尖高效再生体系:成熟大豆种子浸泡24h后,用1:1的1.2%的次氯酸钠和0.1%的升汞混合液处理大豆10min,收集胚尖并转入芽诱导分化培养基MS+0.08 mg/L TDZ,30d后将长有丛生芽的胚尖转入拔高培养基MS+2.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA中,20d后切取苗高大于5cm的植株,转入生根培养基1/2MS+0.5mg/LNAA中,30d后待根长到3-4cm后移栽到培养土中;优化了大豆胚尖遗传转化体系:卡那霉素选择浓度为90mg/L,菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为12h,可用氨苄青霉素作为农杆菌的抑制剂;AtMCT、ThMCT和SsMCT三种不同的基因转化植株经过筛选分别得到78、67、82株抗性苗,PCR、RT-PCR、Southern杂交等分子手段对转化子的检测结果表现为阳性。首次利用TDZ诱导大豆胚尖的分化,建立了高效的大豆胚尖再生体系,丛生芽分化率高达92.6%;优化了大豆胚尖遗传转化系统,转化率高达15%;首次将来自拟南芥、盐芥和盐地碱蓬的阴离子清除有关的基因甲基转移酶基因在大豆中进行了异源表达,分子检测结果表明外源基因已转入大豆中并进行了表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物耐盐效应决定子（DETERMINANTS）研究综述
• 1.1.1 植物耐盐效应分子功能分类
• 1.1.2 植物耐盐调节分子
• 1.2 植物耐盐基因工程研究概述
• 1.2.1 渗透保护物质代谢的基因工程
• 1.2.2 自由基清除的基因工程
• 1.2.3 离子均衡的基因工程
• 1.2.4 胁迫相关蛋白的基因工程
• 1.2.5 信号转导通路分子的基因工程策略
• 1.3 大豆遗传转化研究进展
• 1.3.1 大豆遗传转化的受体系统
• 1.3.2 大豆遗传转化系统
• 1.4 甲基卤化物转移酶研究进展
• 1.4.1 甲基卤化物
• 1.4.2 卤甲烷合成释放途径
• 1.4.3 臭氧层破坏与卤代甲烷的关系
• 1.4.4 植物甲基转移酶的功能与分类
• 1.4.5 甲基转移酶的作用机制
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 大豆胚尖高效再生体系的优化
• 2.1 实验材料和培养条件
• 2.1.1 种子及其来源
• 2.1.2 化学试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养条件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种子灭菌方法的优化选择
• 2.2.2 外植体的优化选择
• 2.2.3 TDZ（赛苯隆，Thidiazuron）水平对大豆胚尖出芽率的影响
• 2.2.4 拔高培养基的优化
• 2.2.5 大豆生根的优化方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 大豆种子灭菌方法的优化选择
• 2.3.2 外植体的优化选择
• 2.3.3 TDZ 水平对大豆胚尖出芽率的影响
• 2.3.4 拔高培养基的优化
• 2.3.5 大豆生根的优化方法
• 2.4 讨论
• 2.4.1 大豆胚尖高效再生体系的优化
• 2.4.2 大豆生根和炼苗的优化
• 第三章 耐盐大豆遗传转化分子机制的探讨
• 3.1 实验材料和培养条件
• 3.1.1 种子及其来源
• 3.1.2 菌种及载体
• 3.1.3 酶及化学试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 培养条件
• 3.1.6 主要仪器设备
• 3.1.7 引物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 大豆胚尖的灭菌与切取
• 3.2.2 筛选压的优化选择
• 3.2.3 菌液的浓度及浸染时间的优化选择
• 3.2.4 不同的农杆菌抑制剂对大豆生根的影响
• 3.2.5 碱裂解法提取大肠杆菌质粒
• 3.2.6 农杆菌感受态的制备及转化（直接转化法）
• 3.2.7 农杆菌质粒的提取与鉴定及菌液准备
• 3.2.8 农杆菌介导的大豆遗传转化
• 3.2.9 转基因植株的筛选
• 3.2.10 转基因植株外源基因的PCR 检测
• 3.2.11 转基因植株的RT-PCR 检测
• 3.2.12 DNA 的提取及Southern 分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 筛选压的优化选择
• 3.3.2 菌液的浓度及浸染时间的优化选择
• 3.3.3 不同的农杆菌抑制剂对大豆生根的影响
• 3.3.4 农杆菌中外源基因的PCR 检测
• 3.3.5 转基因植株的筛选
• 3.3.6 转基因植株的PCR 检测
• 3.3.7 转基因植株的RT-PCR 检测
• 3.3.8 转基因植株的Southern 检测
• 3.4 分析与讨论
• 3.4.1 大豆遗传转化体系的探索
• 3.4.2 耐盐大豆遗传转化分子机制的探讨
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表