人肝细胞系和组织的糖蛋白质表达谱研究

论文摘要

第一部分基于MP技术的人肝细胞系糖蛋白质表达谱的比较分析目的：构建正常人肝细胞系（Chang’s liver）和不同转移潜能人肝癌细胞系（Hep3B和MHCC97H）的糖基化蛋白表达谱和数据库，比较研究其蛋白质糖基化程度的差异。筛选与肝癌发生和转移相关的糖蛋白质分子以及相关的蛋白糖基化改变。方法：首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白，进行双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE），然后用复合蛋白质组学技术（multiplexed proteomics，MP）进行胶上的糖蛋白和总蛋白染色，得到不同细胞系糖基化蛋白和总蛋白表达谱，用2-DE分析软件Dymension进行点探测，将糖蛋白质点用基质辅助的激光解吸离子化-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption／ionization-time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS／MS）鉴定，构建三个细胞系的糖蛋白数据库。最后用Dymension软件比较分析不同细胞系糖蛋白表达谱中糖蛋白的糖基化程度差异。结果：用2-DE结合MP技术，获得三个不同细胞系糖蛋白表达谱，Dymension软件探测到正常人肝细胞系Chang’s liver糖蛋白质点74±2个（n=3）、非转移人肝癌细胞系Hep3B糖蛋白质点78±3个（n=3），高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H糖蛋白质点72±5（n=3）。以其中2-DE效果好、点数最多的一块胶即Hep3B图谱作为参考胶，进行2组间的匹配分析，Chang’s liver与其匹配的平均匹配点数为31±3个（n=3），MHCC97H与其匹配的平均匹配点数为36±4个（n=2）。质谱鉴定出Chang’sliver糖蛋白质点63个，Hep3B糖蛋白质点59个，MHCC97H糖蛋白质点52个。另外经Dymension软件分析显示三种细胞系不但表现出明显的差异性糖蛋白表达谱，而且相同的糖蛋白，其糖基化程度也存在明显差异。与Chang’s liver相比，Hep3B发生糖基化改变的糖蛋白25个：与Hep3B相比，MHCC97H发生糖基化改变的糖蛋白29个。结论：MP技术是探测胶上糖蛋白较敏感的方法，且与下游的质谱鉴定有很好的兼容性。2-DE结合MP和质谱鉴定技术能够构建肝细胞系糖蛋白数据库，这是糖蛋白质组学研究的一个新颖的技术平台。实验结果也显示肝癌的发生和侵袭转移不但与细胞内差异糖蛋白相关，而且一些糖蛋白的糖基化改变可能也与肝癌的发生和转移相关。第二部分基于MP技术的正常人肝组织糖蛋白表达谱和数据库的构建目的：高通量、规模化地研究正常人肝组织糖蛋白，构建正常人肝组织的糖蛋白表达谱和数据库。方法：首先抽提正常人肝组织总蛋白，进行双向电泳（2-DE），然后用复合蛋白质组学技术（MP）进行胶上的糖蛋白和总蛋白染色，得到正常人肝组织的糖基化蛋白和总蛋白表达谱，用2-DE分析软件PDQuest进行点探测并分析，切取糖蛋白质点，用基质辅助的激光解吸离子化—飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS／MS）鉴定，构建正常人肝组织的糖蛋白数据库。结果：通过MP技术从正常人肝组织2-DE胶上探测到1011个糖蛋白质点，1923个总蛋白质点。质谱成功地鉴定出116种糖蛋白。结论：2-DE结合MP和质谱鉴定技术构成的新颖技术平台能够用于构建人肝组织的糖蛋白数据库。这个数据库为今后人肝脏组织的生理和病理学研究奠定了必要的基础。第三部分人肝细胞系和组织糖蛋白质组的生物信息学分析验证目的：应用生物信息学方法对已有数据库信息进行归纳、处理和分析，以期发掘更多在肝癌诊断和转移预测中有潜在意义的标志物，并发现糖蛋白在肝癌发生和转移中的作用规律。方法：利用网上生物信息学数据库资源和生物信息学软件对数据库中糖蛋白进行糖基化位点、糖蛋白功能分析及预测，绘制糖蛋白相互作用网络（Protein interaction network）图，并进行信号肽的预测。结果：（1）在第一和第二部分已建立的糖蛋白数据库中的所有糖蛋白均有潜在糖基化位点，约90％有预测的糖基化位点。（2）正常肝细胞系（Chang’s liver）、非转移（Hep3B）和高转移肝癌细胞系（MHCC97H）比较，差异糖蛋白分子主要包括：应激蛋白，氧化还原调节蛋白，参与核酸生物合成的蛋白，细胞骨架蛋白和蛋白降解酶。（3）蛋白相互作用网络显示正常肝细胞系、非转移和高转移肝癌细胞系之间的差异糖蛋白分子，与其相互作用的蛋白分子基本上均参与细胞的增殖和分化。（4）信号肽预测差异糖蛋白显示有11种是分泌蛋白。结论：一些糖蛋白质和细胞增殖分化相关的蛋白分子形成了庞大的“相互作用网络”，共同促进肝细胞的恶性增殖。为肝癌的诊断和转移预测需引进“分子群”的概念提供基础。对于含信号肽的差异糖蛋白，进一步的血清验证可能为肝癌诊断和转移提供更多潜在的分子标志，它们的糖基化改变也可以作为一种新的糖指标来预示肝癌的发生和转移。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 基于MP技术的人肝细胞系糖蛋白质表达谱的比较分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 基于MP技术的正常人肝组织糖蛋白表达谱和数据库的构建
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 人肝细胞系和组织糖蛋白质组的生物信息学分析验证
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 一 糖蛋白质组学的含义及历史背景
• 二 研究糖蛋白质组学的意义
• 三 糖蛋白质组学的研究方法及策略
• 四、糖蛋白组学研究现状及我国应对策略
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在校期间发表的论文
• 在校期间获得的荣誉