论文摘要
人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的，其中尤以单碱基的突变，即单碱基多态性最为普遍。实现对这些基因单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前，有关单碱基突变的检测方法已有许多报道。而这些传统的方法普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵、而且对工作人员要求较高的专业技能，因此仅能在少数实验室应用。开发一些简便、廉价、精确且易于临床推广的方法是一件很有价值的工作。此外，由于电化学生物传感器具有制造简单、灵敏度高、价格低廉而被广泛研究，并已在生物检测中逐步得到了应用。本文分别研究了运用DNA连接酶、链亲和素碱性磷酸酶来检测基因的单碱基突变、基因分型及人免疫球蛋白。现将所作的工作简单的叙述一下：第一部分：结合了DNA连接酶的高忠实性以及链亲和素碱性磷酸酶的催化作用对K-Ras癌基因的单碱基突变进行定性及定量分析。金电极表面固定的探针和待检测的突变链是互补的，在连接酶、突变目标链以及5’-磷酸化的连接探针存在下，表面固定的探针会和连接探针连接起来。在90℃下进行热处理变性。接着，生物素化的检测探针和连接产物进行互补配对反应。再接着加入链亲和素化的碱性磷酸酶，通过生物素和链亲和素的特异性识别作用，链亲和素化的碱性磷酸酶结合到了电极表面。在碱性磷酸酶的作用下，非还原性的抗坏血酸2-磷酸（AA-P）转化成抗坏血酸（AA）。溶液中的银离子在抗坏血酸的作用下，被还原成银，从而使得银颗粒沉积在电极表面。线性扫描伏安法被用来检测电极表面沉积的银。这种方法已经成功的用于检测编码K-Ras癌基因的第12位密码子的单碱基突变，其检测下限为80fM。第二部分：基于第一部分的原理，结合DNA连接酶和碱性磷酸酶，测定多药耐药基因MDR1的基因分型。多药耐药基因MDR1的基因分型有3种，分别为C-C型、C-T型和T-T型。对基因分型的检测是在两个金电极上进行的，这两个金电极分别通过自组装巯基DNA而固定上探针DNA，接着加入待测的目标链，如果目标链和探针DNA互相匹配，则能产生响应。反之，则不能。通过两个电极的最终反应结果，我们可以得知具体的基因分型。第三部分：发展了一种生物沉积铜并以铂催化氢还原伏安法进行检测的高灵敏电化学免疫分析新方法。该方法采用夹心免疫分析模式，实现了人免疫球蛋白（H IgG）的测定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗H IgG捕获抗体，H IgG捕获后，碱性磷酸酶标记的H IgG抗体通过与H IgG形成夹心复合物而结合在微孔板上。结合的碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯底物水解产生抗坏血酸，后者还原铜离子沉积于镀有铂的玻碳电极表面。通过测定铂催化氢还原的电位差，可实现H IgG的高灵敏分析。催化氢还原电压差值与H IgG浓度对数在1μg／ml-100 pg／ml之间呈线性相关性。由于铂催化氢还原的高灵敏度及碱性磷酸酶介导的生物沉积放大反应，该法具有较高的分析灵敏度，且免疫分析微孔板模式使得该法可同时用于大量样品的分析。
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标签：连接酶论文; 碱性磷酸酶论文; 生物催化沉积论文; 点突变论文; 基因分型论文; 电化学免疫试验论文; 催化氢波电化学检测论文;