云斑车蝗线粒体基因组序列测定与分析

论文摘要

基于长PCR的二次PCR策略,采用PCR直接测序和克隆测序相结合的方法,对直翅目蝗总科昆虫云斑车蝗线粒体基因组进行测定和拼接和注释。联合GenBank收录以及本实验室所测定的其他29种直翅目昆虫的线粒体基因组数据,以线粒体rRNA基因为分子标记,对直翅目昆虫系统发育关系进行了研究。主要结论如下:1、云斑车蝗线粒体基因组长度为15904bp。基因组成包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因和一段非编码的A+T富集区。其中N链共编码14种基因,包括4个蛋白质基因,2个rRNA基因和8个tRNA基因,其余基因由J链编码,各基因的排列顺序与非洲飞蝗相同。2、线粒体基因组在整体水平,以及蛋白编码基因、tRNA基因和rRNA基因,A+T富集区各个区段均存在很高的A+T含量偏向性。其中最高的区段为A+T富集区与两个rRNA基因。蛋白质编码基因的A+T含量在第3位密码子位点上最高,超过了A+T富集区。3、云斑车蝗线粒体有10处基因重叠共45 bp,其中有4处是蛋白质基因与tRNA基因之间的重叠,2处是蛋白质基因间的重叠,1处为rRNS基因与tRNA基因间的重叠,其余为tRNA间重叠。基因间隔区为19处共86bp。基因重叠区的存在以及微小的间隔区说明了线粒体基因结构的紧凑性。4、云斑车蝗蛋白质基因的起始密码子中,除COⅠ和ND5均使用TTG以外,均为昆虫典型的起始密码子ATN。所使用的终止密码子中,13个蛋白质基因中有12个是普通的TAA或TAG,其中COⅠ和ND3为TAG,只有ND5使用了不完全终止密码子T。蛋白质基因的氨基酸组成中以Leu、Ser、Ile、Phe的使用率最高。5、在所预测的所有tRNA二级结构中,除tRNASer（AGN）以外都能形成典型的三叶草二级结构。反密码子和多数六足动物一致,多为GNN或UNN。反密码子环和氨基酸接受臂非常保守,其它臂环的变异较大。在预测的tRNA二级结构中总共出现了19对碱基错配,其中有14对为GU错配。6、两个rRNA基因的位置比较保守。预测了SRNA二级结构。SrRNA二级结构由三个结构域共30个茎环组成。结构域Ⅰ与结构域Ⅱ在所比较的几个物种中均有变化,结构域Ⅲ则比较保守。LrRNA二级结构由6个结构域共44个茎环组成,与其他物种相比,仅在某些位置茎的长度与环的大小略有差异。7、在云斑车蝗A+T富集区发现了3个串联重复序列,rpt1,rpt2和rpt3。Rpt1和Rpt2长度均为166 bp,核苷酸序列完全相同。Rpt3长120 bp,与Rpt1和Rpt2的前120 bp相比只有一个碱基不同。3个重复单位之间没有间隔。8、对30种直翅目昆虫线粒体的SrRNA数据集、LrRNA数据集及联合数据集,进行了系统发育分析。结果支持癞蝗科,瘤锥蝗科和锥头蝗科为蝗总科中比较早分歧的类群,支持斑翅蝗科、斑腿蝗科和网翅蝗科的单系性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 线粒体基因组学研究概况
• 1.1 动物线粒体基因组结构特征
• 1.2 动物线粒体基因组的遗传特征
• 1.3 动物线粒体基因组的进化
• 2 线粒体基因组研究方法
• 2.1 线粒体基因组的分离纯化
• 2.2 线粒体基因组测序策略
• 3 昆虫纲全线粒体基因组测序现状
• 4 直翅目分类简介
• 4.1 直翅目简介
• 4.2 蝗总科简介
• 4.3 斑翅蝗科简介
• 4.4 云斑车蝗形态特征
• 5 本研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本的采集、保存与鉴定
• 1.2 实验仪器和试剂
• 2 实验方法
• 2.1 总DNA提取
• 2.2 总DNA检测
• 2.3 PCR引物设计及PCR扩增
• 2.4 Sub—PCR扩增产物测序
• 3 数据处理和分析
• 3.1 测序结果的片段拼接
• 3.2 线粒体基因组序列的注释
• 3.3 线粒体基因组基因组成情况的分析
• 3.4 RNA的二级结构的预测
• 4 直翅目昆虫线粒体rRNA分子系统发育分析
• 4.1 序列数据来源
• 4.2 序列比对
• 4.3 序列组成分析
• 4.4 系统发育信号检验
• 4.5 建树
• 第三部分 实验结果与分析
• 1 实验结果
• 1.1 基因组总DNA提纯
• 1.2 长PCR扩增和纯化
• 1.3 Sub—PCR扩增和纯化
• 1.4 Sub—PCR产物直接测序或克隆测序
• 2 序列拼接
• 3 线粒体基因组的注释结果
• 3.1 基因组结构
• 3.2 蛋白质基因
• 3.3 tRNA基因
• 3.4 rRNA基因注释及分析
• 4 直翅目昆虫系统发育分析
• 4.1 序列比对
• 4.2 数据集系统发育信号检验
• 4.3 构建系统发育树
• 第四部分 讨论
• 1 线粒体蛋白质基因的起始和终止
• 2 密码子使用偏向性
• 3 tRNA二级结构
• 4 A+T富集区
• 5 rRNA二级结构
• 6 直翅目昆虫的系统发育关系
• 第五部分 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果