论文摘要
一、目的与意义类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为主要临床表现的慢性、进行性、系统性疾病。根据流行病学调查结果显示,全世界成人发病率为0.5～1%;在我国成人RA患病率约为0.3%。RA有较高的致残率,患者往往承受巨大的心理压力,生活质量较常人明显降低。RA属于多因子致病,其具体发病原因至今尚未完全阐明。从总体上讲,该病是在遗传易感性的基础上,由外界因素促发的一种疾病。此外,身高、体重、性别、情绪、气候、环境等和RA的发病也有密切的关系。T细胞谱系是认识RA病理机制的里程碑。目前较为流行的观点是RA为抗原呈递细胞和CD4+T细胞相互作用的结果。此外T细胞介导的关节炎症反应也与滑膜中TCRγδT细胞有关。Th1/Th2动态平衡的失调也是RA病理机制之一,其中恒定性自然杀伤性T细胞即可以产生保护性Th2细胞因子。细胞因子网络是RA病理破坏过程的关键环节。其中肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosis factor-α,TNF-α）和白介素1（Interleukin-1,IL-1）在RA疾病的研究中备受关注。它们可能对滑膜炎症的发生、发展及滑膜血管翳的形成具有十分重要的作用。除此之外,尚有部分白介素家族、趋化因子家族、生长因子家族等直接参与组织损伤。病理机制的不确定性导致治疗上的多靶点和盲目性。现代医学在RA的临床治疗,现今仍然是以非甾体抗炎药（NSAIDs）、改变病情药（DMARDs）和皮质激素为主,这些药物在很大程度上可以改善病情,缓解症状,但是长期服用存在着许多的不良反应,如NSAIDs的胃肠道反应和肾毒性,DMARDs中甲氨喋呤、环磷酰胺的胃肠道反应和肝毒性,来氟米特（Leflunomide,LEF）可引起月经不调、继发性肺部及皮肤炎症等,皮质激素增加感染的易感性、引起消化道溃疡和骨质疏松等。而近几年出现的针对某些关键细胞因子的生物制剂如重组人Ⅱ型TNF-α受体—抗体融合蛋白,重组人IL-1受体拮抗剂、抗TNF-α单克隆嵌合抗体等已经应用于临床,取得一定的疗效,但因其价格昂贵,并容易形成新的免疫紊乱,存在一定的风险,因此尚无法大范围地推广。中医虽然无RA这一病名的记载,但是根据RA的发病特点和临床表现,多将其归属于“痹病”范畴,因其特异的证候特点,又有“顽痹”、“历节风”之称。中医对痹病的认识已有两千多年的历史,对它的病因、病机、辨证论治等方面进行了长期而广泛深入的探讨,形成了较完整的理论系统,在临床上有着自己独特的优势。近年来各医家对“风寒湿”理论也作了较多的补充,如“肾虚”论、“虚、邪、瘀”论等。因而在RA的临床治疗上,中医药一直发挥着重要作用。因此,如何利用传统中医药的特长,加大传统有效方和经验方的开发研究,更好地为风湿病临床服务,是当今中医药界奋斗的目标。风湿康（Feng Shi Kang,FSK）是吴启富教授治疗风湿病临床应用二十多年的经验方,具有清热除湿、活血通络、理气止痛功效,其药物组成有:黄柏、牛膝、苍术、知母、细辛、秦艽、桂枝、徐长卿等。本研究拟用动物疼痛和炎症模型来研究FSK对急、慢性炎症的抗炎镇痛效果,用佐剂性关节炎（AdjuvantArthritis,AA）动物模型观察FSK对AA鼠病理改变的影响,并初步探讨其基本作用机制。二、方法与内容2.1 FSK抗炎镇痛作用的研究2.1.1小鼠扭体实验取雌性小鼠50只,随机分为5组,即空白对照组、布洛芬组、FSK低、中、高剂量组,连续灌胃给药3d,于末次给药后30min,每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.2ml,观察小鼠在20min内出现的扭体次数。2.1.2小鼠热板实验取体重18～22g的雌性小白鼠,置于（55±0.5）℃热板上,观察小鼠舔后足的所需时间（s）,作为痛阈指标。选择痛阈在10～30s的小鼠50只,随机分为5组,即空白对照组、布洛芬组、FSK低、中、高剂量组,连续灌胃给药3d。分别记录给药前、给药后30min、60min、90min的痛域值。2.1.3二甲苯致小鼠耳肿胀实验取雄性小鼠50只,随机分为5组,即空白对照组、强的松组、FSK低、中、高剂量组,连续灌胃给药3d,于末次给药后30min,每鼠右侧耳廓正反面均匀涂抹二甲苯15μl,15min后脱臼处死,沿耳廓对称剪下小鼠两耳,用打孔器在左右耳廓相同部位打孔取材,精密电子天平称量,计算肿胀度（mg）。2.1.4腹腔毛细血管通透性增高实验取雌性小鼠50只,随机分为5组,即空白对照组、强的松组、FSK低、中、高剂量组,连续灌胃给药3d,于末次给药后30min,各小鼠尾静脉注射0.5%依文思兰溶液,随即腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液,20min后脱颈椎处死,腹腔注射5ml生理盐水,轻揉小鼠腹部,使腹腔内染料充分溶于生理盐水中并混合均匀,剪开腹部肌肉,吸管吸出洗涤液,离心,取上清液在紫外分光光度计上595nm比色测定吸光度。2.2 FSK对大鼠AA的影响选取AA模型鼠50只,随机分为5组,即空白对照组、模型组、LEF组、FSK低剂量组、FSK高剂量组,从致炎当天开始灌胃给药,连续给药30天。给药过程中纪录模型鼠的体重、足容积及炎症积分的变化。第30天处死大鼠,膝、踝关节取材,常规切片HE染色,并进行组织学观察和评分。2.3 FSK药理机制的初步探讨2.3.1 FSK对AA T淋巴细胞亚群的影响取抗凝血100μl,依次加入FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8a抗体孵育,再加入红细胞裂解液,以PBS洗涤,悬浮细胞上机检测。2.3.2 FSK对AA TNF-α、IL-1的影响用ELISA法测定大鼠血清中TNF-α和大鼠关节组织匀浆中IL-1的含量,比较五组之间的药物干预对大鼠炎症细胞因子的影响。三、结果与分析3.1 FSK抗炎镇痛作用的研究与空白对照组相比,布洛芬组、FSK低、中、高剂量组的小鼠在20min内扭体次数均有显著性差异（F=30.118,P=0.000）,提示各个药物组均能减少小鼠扭体反应的次数,对小鼠疼痛有抑制作用。在热板实验中,在不同时间内的痛域值有显著性差异（F=19.401,P=0.000）,各个药物组之间的痛域值差异有显著性意义（F=5.250,P=0.001）。与空白对照组相比较,布洛芬组、FSK低、中、高剂量组的痛域值呈现上升趋势,在第90min时,痛域值差异具有显著性（P=0.013）。在耳肿胀实验中,强的松组及FSK低、中、高剂量组的肿胀度均低于空白对照组。结果提示各个药物组均能抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀度,对急性炎症具有抑制作用。在腹腔毛细血管通透性增高实验中,强的松组、FSK低、中、高剂量组的伊文思兰的含量均低于空白对照组,提示强的松和FSK均能抑制冰醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增高,使腹腔渗出的染料减少,对急性渗出性炎症显示出抗炎作用。3.2 FSK对大鼠AA病理改变的影响致炎后,足肿胀度与炎症积分在不同时间点以及不同观察组之间的变化均具有显著性差异,并且两者的改变趋势基本一致。模型组的平均肿胀度和炎症积分均高于其他观察组。而LEF组和FSK低、高剂量组的足肿胀度和炎症积分从第13天和第16天开始后就表现出下降的趋势,这说明FSK对AA的急性期炎症有较好的抑制作用,但较LEF组起效时间缓慢。从病理观察结果来看,LEF组和FSK低、高剂量组病理积分显著低于模型组（F=5.121,P=0.005）,说明LEF、FSK对AA急性期炎症有一定的抑制作用。3.3 FSK药理机制的初步探讨空白对照组、模型组、LEF组、FSK低、高剂量组之间的CD4+含量有显著性差异（F=5.840,P=0.002）,CD8+含量无显著性差异（F=2.733,P=0.052）,以及CD4+/CD8+的比值差异显著（F=12.233,P=0.014）。LEF组、FSK低、高剂量组的CD4+水平与模型组相比较降低,CD8+水平增加,CD4+/CD8+的比值下降。同时发现,空白对照组、模型组、LEF组、FSK低、高剂量组的TNF-α和IL-1浓度均有显著性差异（F=2.698,P=0.044;F=11.327,P=0.000）。和空白组相比,模型组的TNF-α和IL-1浓度均上升;和模型组相比,LEF组、FSK低、高剂量组的TNF-α和IL-1浓度均降低。四、结论4.1 FSK对急性炎症有较好的抗炎、镇痛作用,能够延长物理刺激和化学物质所引起的急性疼痛的痛域,在以血管通透性为主要改变的急性炎症模型实验中,对二甲苯导致的鼠耳肿胀和对冰醋酸引起的腹腔血管通透性的升高有抑制作用,这些实验均能表明FSK具有抗炎镇痛作用。4.2 AA动物试验表明,FSK能够控制急性期炎症,减轻炎症症状表现,降低炎症严重程度,能够抑制AA炎症发展过程中滑膜增生、纤维化、炎细胞浸润、软骨和骨的破坏等一系列改变。4.3 FSK对AA的病理改变抑制作用的机理可能在于:FSK可能通过对外周血中紊乱的T细胞亚群的调节来发挥对炎症的抑制作用。同时FSK的抑制作用与减少TNF-α和IL-1的生成有关。
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