野猪家猪AMPD1基因的克隆、表达和遗传变异的研究

论文摘要

腺苷一磷酸脱氨酶（AMPD）是仅在真核生物中发现的一种酶,是嘌呤代谢中的关键酶之一,它的作用是催化AMP（一磷酸腺苷）脱氨生成IMP（肌苷酸）。AMPD基因由多基因家族编码,家族成员有AMPD1、AMPD2、AMPD3。AMPD1基因在所有的真核生物中都存在,但主要在骨骼肌中高水平表达。有研究发现AMPD1基因与NGFB基因紧密连锁,因NGFB基因定位区域与肉质胴体性状（如胴体重、肩肉重、肌肉重、肌肉面积等）有关,所以也将AMPD1基因作为胴体性状的候选基因来研究。本研究以人、鼠的AMPD1基因序列为基础,首次克隆了野猪和家猪AMPD1基因的cDNA序列;并且以野猪、民猪、大白、长白、杜洛克为研究对象,利用PCR-SSCP方法检测它们的多态性,探讨不同基因型在不同品种（系）间的分布规律;采用半定量RT-PCR方法研究了这个基因在不同组织及相同组织不同生长时期的表达特性。主要研究结果如下:1.采用同源克隆首次克隆了家猪和野猪AMPD1基因的cDNA序列,猪AMPD1基因编码区全长2244 bp,编码747个氨基酸;野猪AMPD1基因cDNA全长2240 bp,开放阅读框位于3992240 bp,编码613个氨基酸。采用生物信息学方法对其编码的多肽链进行了结构和功能域的初步分析。2.采用PCR-SSCP方法在AMPD1基因编码区上共寻找到11个单核苷酸突变,其中有4个突变属于错义突变。群体遗传学分析表明,所检测的4个位点中,5个品种间基因型的分布均存在着极显著的差异（P<0.01）;野猪和民猪之间除了S5位点基因型的分布存在显著差异外（0.01<P<0.05）,其他3个位点上基因型分布差异均不显著（P>0.05）。3.半定量RT-PCR方法检测了野猪和纯种大白猪AMPD1基因在心、肝、胃、肾、脾、肺、肌肉、大肠、小肠、性腺共10种组织表达情况,结果表明猪的AMPD1基因仅在其肌肉组织中表达;同时检测了AMPD1基因肌肉组织不同生长时期的表达特性,结果显示AMPD1基因在1日龄大白猪肌肉组织中表达量最高,其次是7日、15日、21日龄,3月龄表达较少,6月、9月、12月龄几乎不表达,随着日龄的增加,表达量呈依次减弱的趋势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 腺苷一磷酸脱氨酶的研究
• 1.1.1 AMPD 基因家族
• 1.1.2 AMPD1 的特性和结构
• 1.2 AMPD1 基因在遗传育种中的研究
• 1.2.1 AMPD1 基因与肉质性状和风味
• 1.2.2 AMPD1 基因多态性与临床疾病
• 1.3 本研究的主要内容及目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物组织样
• 2.1.2 菌株和克隆载体
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要药品和酶
• 2.1.5 缓冲液及主要溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 耳组织样DNA 的提取及检测
• 2.2.2 组织样总RNA 的提取与检测
• 2.2.3 引物设计与合成
• 2.2.4 猪AMPD1 基因cDNA 的克隆
• 2.2.5 PCR-SSCP 检测
• 2.2.6 基因多态性的统计方法
• 2.2.7 半定量RT-PCR 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 猪AMPD1 基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 猪AMPD1 基因cDNA 克隆
• 3.1.2 AMPD1 基因结构、功能的分析
• 3.1.3 AMPD1 基因分子进化分析
• 3.1.4 野猪AMPD1 基因的克隆及与家猪序列的同源性比对
• 3.2 多态性分析
• 3.2.1 AMPD1 基因单核苷酸多态性分析
• 3.2.2 不同品种猪AMPD1 基因多态位点的基因和基因型频率
• 3.2.3 AMPD1 基因不同位点的遗传多态性分析
• 3.3 猪AMPD1 基因的表达特性分析
• 3.3.1 线性增长实验
• 3.3.2 猪AMPD1 基因不同组织的表达
• 3.3.3 不同生长时期肌肉组织中AMPD1 基因的表达
• 4 讨论
• 4.1 猪AMPD1 基因的克隆
• 4.2 猪AMPD1 基因的遗传变异分析
• 4.3 AMPD1 基因的表达特性分析
• 4.4 关于取样、DNA 与RNA 提取和反转录反应
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文