Zwittermicin A生物合成基因簇的研究

论文题目: Zwittermicin A生物合成基因簇的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 邵铁梅

导师: 黄大昉,刘大群

关键词: 文库,生物合成基因簇

文献来源: 河北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)是一类分布极其广泛的革兰氏阳性细菌,在特定生理阶段产生芽孢,并形成具有杀虫活性的伴孢晶体。随着对Bt研究的不断深入,又发现了许多与杀虫相关的其它有效成分,如辅助蛋白(Helper protein)、营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs)和增效物质Zwittermicin A。Zwittermicin A是一种新型广谱抗生素,该抗生素可抑制多种真核微生物和原核微生物,其中包括多种植物病原菌,而且与Bt毒素共同使用能显著提高其杀虫活性。本文对国内一批Bt菌株进行了筛选;对影响Zwittermicin A生成和活性的条件进行了探索;对Bt菌株G03的Zwittermicin A合成基因簇进行了克隆、分析、及部分开放阅读框的功能验证。采用PCR与抑菌活性相结合的方法对国内196株Bt菌株进行筛选,有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性明显高于其余的46株。 Bt菌株G03高产Zwittermicin A,有很高的抑菌活性。选用营养程度不同的培养基对Bt菌株G03进行培养、结合菌体观察和培养液上清液活性测定,证明Zwittermicin A的生成与芽孢的产生无依赖关系:通过测定超声波处理前后的上清液的抑菌活性差异,证明Zwittermicin A的生成和分泌之间有时间的延迟;并测定了不同pH值对Zwittermicin A抑菌活性的影响,发现其在中性偏碱的环境中活性较高。从G03克隆了zmaR全长基因,并完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,编码的蛋白质由375个氨基酸残基组成,分子量为43.5kDa,等电点pI4.95。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,该基因可正常表达,使宿主菌BL21获得对Zwittermicin A的抗性。构建了Bt菌株G03基因组的BAC文库,该文库包含4713个克隆,平均插入片断大小为73kb,该文库相当于59个库容量。采用PCR方法对该库的1000个克隆进行筛选,得到4个阳性克隆,其中两个阳性克隆(插入片段分别为65kb和94kb)包含已发表的16kb Zwittermicin A合成基因簇(发表的16kb序列为部分Zwittermicin A合成基因簇)。对插入片段为65kb的阳性克隆进行测序、分析,得到36.665kb的序列,共包括15个开放阅读框,在已发表的Zwittermicin A合成基因簇基础上又发现了完整的orf9,和5个新的开放阅读框,3个位于已发表序列的上游,命名为orfA、DrfB、orfC,2个位于已发表序列的下游,命名为orfN和orfO。新发现的开放阅读框编码的蛋白与聚酮类抗生素和多肽类抗生素合成酶有较高的同源性,Zwittermicin A的合成可能是聚酮类抗生素和多肽类抗生素的杂合途径。对orfC的功能基因进行了验证,通过重叠PCR方法构建了orfC的突变盒,插入温度敏感的E.coli-Bt穿梭载体pRN5101得到突变质粒pRNC,导入产Zwittermicin A的Bt菌株218,经高温突变获得orfC突变株,突变株丧失了抑菌活性。将orfC全长基因导入突变株后,又使其恢复了抑菌活性,表明orfC是Zwittermicin A合成必需的。本研究为进一步开展Zwittermicin A同Bt增效作用及其分子机制的研究提

论文目录:

引言

1 苏云金芽孢杆菌的概述

2 Zwittermicin A 的研究进展

2.1 Zwittermicin A 的发现及其生物活性

2.2 培养时期和培养条件对Zwittermicin A 累积量的影响及Zwittermicin A 的纯化

2.3 Zwittermicine A 的抑菌机制

2.4 Zwittermicin A 抗性基因的克隆和抗性机理的研究

2.5 Zwittermicin A 生物合成基因簇的研究

3 抗生素生物合成基因簇分离克隆的策略

4 细菌人工染色体的研究应用

4.1 BAC克隆载体的形成背景

4.2 BAC克隆载体的构建及其发展

4.3 细菌人工染色体的应用

5 立题依据及目的意义

5.1 立题依据

5.2 目的意义

第一章苏云金芽孢杆菌菌株Zwittermicin A 活性的研究

1 材料方法

1.1 菌株与质粒

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 仪器设备

1.5 含zmaR基因Bt菌株的筛选

1.6 含zmaR基因的Bt菌株的抑菌活性测定

1.7 Zwittermicin A 的累积与Bt芽孢形成的关系

1.8 Zwittermicin A 的生成与分泌的关系

1.9 不同pH值对Zwittermicin A 抑菌活性的影响

2 结果与分析

2.1 含zmaR基因Bt菌株的筛选

2.2 抑菌活性测定方法的改进

2.3 含zmaR基因Bt菌株抑菌活性的测定

2.4 Zwittermicin A 的累积与Bt芽孢形成的关系

2.5 Zwittermicin A 的合成与分泌的关系

2.6 不同pH值对Zwittermicin A 抑菌活性的影响

3 讨论

4 小结

第二章苏云金芽孢杆菌菌株G03 Zwittermicin A 抗性基因的研究

1 材料方法

1.1 菌株与质粒

1.2 培养基及抗生素

1.3 试剂

1.4 仪器设备

1.5 苏云金芽孢杆菌G03菌株zmaR基因的克隆

1.6 苏云金芽孢杆菌G03菌株zmaR基因表达及活性检测

2 结果与分析

2.1 Bt菌株G03 zmaR基因的克隆

2.2 zmaR基因序列测定与分析

2.3 ZmaR蛋白SDS-PAGE分析结果

2.4 ZmaR蛋白的活性检测

3 讨论

4 小结

第三章苏云金芽孢杆菌菌株G03 BAC文库的构建

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

1.2 试剂及培养基

1.3 仪器设备

1.4 苏云金芽孢杆菌株G03BAC文库的构建

1.5 BAC文库的筛选

2 结果与分析

2.1 BAC文库的构建

2.2 BAC文库的筛选

3 讨论

3.1 BAC文库构建体系的建立

3.2 酶切片段的选择

3.3 BAC文库的应用前景

4 小结

第四章 Zwittermicin A 生物合成基因簇的克隆、测序及分析

1 材料方法

1.1 菌株与质粒

1.2 试剂

1.3 培养基

1.4 仪器设备

1.5 含Zwittermicin A 生物合成基因簇阳性克隆的亚克隆库构建

1.6 含Zwittermicin A 生物合成基因簇的阳性质粒序列测定

1.7 序列拼接与分析

2 结果与分析

2.1 含Zwittermicin A 生物合成基因簇的阳性BAC质粒序列拼接

2.2 序列分析

3 讨论

4 小结

第五章 OrfC功能的研究

1 材料方法

1.1 菌株与质粒

1.2 试剂

1.3 培养基

1.4 仪器设备

1.5 构建苏云金芽孢杆菌菌株218的开放阅读框orfC突变株

1.6 构建苏云金芽孢杆菌株218的orfc突变株的恢复质粒

1.7 检测突变株及突变株恢复后的抑菌活性

2 结果与分析

2.1 温度敏感型穿梭载体pRNC的构建

2.2 Bt菌株218 orfC突变体的获得及抑菌活性测定

2.3 突变株M218-12功能恢复

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

附录

抗生素Zwitternmicin A的研究进展

发布时间: 2005-08-10

参考文献

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[3].Sansanmycin生物合成基因簇的克隆和生物合成调节基因ssaA调控机制研究[D]. 李青连.北京协和医学院2013
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