甘蔗宿根矮化病菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）检测技术研究

论文摘要

甘蔗是最重要的糖料作物,蔗糖占我国食糖总产的90%以上。由木质部限制性赖氏细菌木质部变种（Leifsonia xyli subsp. xyli, Lxx）引起的甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting diseases, RSD）是世界各甘蔗产区最重要的细菌性病害,且迄今仅能从甘蔗上检测到该菌。通过脱毒技术生产健康种苗是目前世界通用的控制该病害最有效的途径,也是一项有效的增产措施。我国计划大面积推广该技术,2011年已在我国甘蔗主产区的广西、云南、广东和海南布置了9个示范点,标志着我国已正式启动了规模化健康种苗繁育工作。准确、高效、低成本的甘蔗宿根矮化病菌（Leifsonia xyli subsp.xyli, Lxx）检测技术是甘蔗健康种苗产业化应用的支撑技术,也是后续抗RSD育种所必需的技术,因此,课题研究有重要的实际意义和很好的应用前景。为此,本研究围绕甘蔗产业技术需求之一的甘蔗宿根矮化病菌的检测问题,开展了Lxx分离培养、聚合酶链式反应检测技术（PCR）、多克隆抗体制备、血清学检测技术（DB-EIA）和环介导等温扩增检测技术（LAMP）的研究,已取得的主要结果和结论如下：（1）以罹甘蔗宿根矮化病的蔗汁为材料,从中分离、培养了甘蔗宿根矮化病病原菌,经过形态学鉴定、PCR鉴定和纯度鉴定确认为该菌的纯培养物,成功获得目标病原纯培养物为后续建立Lxx检测技术奠定了必不可少的基础。（2）以Lxx菌体蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用该抗体进行斑点酶标免疫试验（DB-EIA）。通过设置1：2000、1：500、1:100三个一抗浓度梯度进行试验,确定了该抗体的最适反应浓度为1：100。在该浓度下进行DB-EIA检测,Lxx菌液、带Lxx菌的蔗汁和叶中脉均可发生免疫反应。抗体特异性试验表明,该抗体可与蔗汁中分离的部分赖氏细菌和赖氏菌模式菌株Leifsonia poae发生交叉反应,说明该抗体特异性不够理想。（3）以ROC22、粤甘18号和粤甘26号为材料,采用PCR方法,以同一带菌植株的节间蔗汁总DNA和叶片中脉总DNA为模板,进行灵敏度测试。在25μL的PCR反应体系中,ROC22节间蔗汁和叶片中脉检出病原的总DNA最低用量分别为0.2ng和2.0ng,粤甘18号节间蔗汁和叶片中脉检出病原的总DNA最低用量分别为1.0ng和10ng,粤甘26号节间蔗汁和叶片中脉检出病原的总DNA最低用量分别为2.0ng和100ng。结果表明,节间和叶片中脉作为甘蔗宿根矮化病菌PCR检测的取材部位均是可行的,且灵敏度均能满足甘蔗植株带菌检测的要求,但节间蔗汁总DNA用量更低,说明蔗汁中的病原菌含量比叶中脉中的高。在对节间蔗汁总DNA和叶片中脉总DNA进行PCR检测时,发现检测产物有4种带型,分别为：与阳性对照条带位置一致的单条带；双条带,其中一条与阳性对照条带位置一致,另一条小于阳性对照条带；双条带,均小于阳性对照条带；小于阳性对照条带的单条带。根据各片段克隆测序结果,确认只要扩增产物中出现与阳性对照位置一样的条带,就可判断为Lxx的特异性扩增,从而判定样本检出阳性,即样本中存在Lxx,否则判定样本未检出Lxx。（4）本研究建立了一种新型、快速、简便、灵敏度高且实用性强的检测方法——甘蔗宿根矮化病菌LAMP检测技术,是甘蔗检测上的第一次尝试。该技术以甘蔗宿根矮化病菌的特异序列为靶序列设计了4条引物,在65℃恒温条件下反应60min即可完成。内外引物浓度比和Mg2+浓度两个条件的优化结果表明,在25μ,L的Lxx-LAMP检测体系中,当内外引物浓度比为4：1,Mg2+浓度为5.75mmol/L时,该检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度。以粤甘18号的蔗汁总DNA和叶片中脉总DNA分别作为PCR和LAMP检测模板的灵敏度比较试验,结果表明以蔗汁总DNA为模板时,LAMP检测方法的灵敏度比PCR高10倍。以叶片中脉总DNA为模板时,LAMP方法的检测灵敏度与PCR法一致。当采用LAMP检测技术时,蔗汁总DNA作为模板的检测灵敏度比叶片中脉高100倍。该技术还具有检测结果判定简单的特点。如果以SYBR Green I （1000×）为指示剂,在显色反应中,反应液呈绿色的即判定为阳性；若采用凝胶电泳检测,出现梯形特征带型的即判定为阳性。环介导等温扩增技术在Lxx检测上的应用成功,为后续针对甘蔗其他病原和转基因成分检测技术的开发提供借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 甘蔗主要细菌性病害及其危害
• 1.1 甘蔗宿根矮化病
• 1.2 甘蔗赤条病
• 1.3 甘蔗白条病
• 1.4 甘蔗流胶病
• 1.5 甘蔗心腐病
• 2 植物病原菌检测技术及其应用
• 2.1 血清学检测技术
• 2.1.1 酶联免疫技术
• 2.1.2 免疫荧光技术
• 2.1.3 斑点免疫结合技术
• 2.1.4 免疫PCR技术（immuno PCR,I-PCR）
• 2.1.5 免疫毛细管区带电泳技术（immuno Capillary Zone Electrophoresis,I-CZE）
• 2.2 基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的检测技术
• 2.2.1 rDNA-PCR
• 2.2.2 ITS-PCR（转录间隔区——PCR）
• 2.2.3 tDNA-PCR
• 2.2.4 PCR-单链构型多态性（PCR single-strand conformational polymorphism,PCR-SSCP）
• 2.2.5 定量PCR（quantitative-PCR,Q-PCR）
• 2.2.6 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR,RT-PCR）
• 2.2.7 基于PCR的基因多态性检测技术
• 2.3 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）
• 2.4 基因芯片技术（gene chip）
• 3 甘蔗宿根矮化病菌检测技术研究进展
• 3.1 显微镜技术
• 3.2 血清学技术
• 3.3 PCR技术
• 3.4 Southern杂交
• 4 本论文研究
• 4.1 本研究的目的和意义
• 4.2 本论文主要研究内容
• 第二章 甘蔗宿根矮化病菌的分离、鉴定及多克隆抗体制备
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 目标菌株来源
• 1.1.2 同属近缘菌株的来源
• 1.1.3 主要仪器设备和试剂
• 1.1.4 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 蔗汁中细菌的分离培养
• 1.2.1.1 甘蔗宿根矮化病病原菌的分离培养
• 1.2.1.2 蔗汁中其它细菌的分离培养
• 1.2.2 甘蔗宿根矮化病菌的显微镜鉴定
• 1.2.2.1 正置相差显微镜观察
• 1.2.2.2 透射式电子显微镜观察
• 1.2.3 甘蔗宿根矮化病菌的PCR鉴定
• 1.2.4 甘蔗宿根矮化病菌的菌液纯度鉴定
• 1.2.4.1 基于真菌通用引物的检测
• 1.2.4.2 基于细菌通用引物的检测
• 1.2.5 目的片段的回收、克隆与测序
• 1.2.5.1 目的片段的回收
• 1.2.5.2 产物与载体的连接
• 1.2.5.3 连接产物转化大肠杆菌
• 1.2.5.4 重组子的PCR鉴定
• 1.2.5.5 序列分析
• 1.2.6 多克隆抗体的制备
• 1.2.6.1 免疫原的制备
• 1.2.6.2 免疫过程
• 1.2.7 抗反应浓度的确定试验
• 1.2.7.1 抗原材料处理
• 1.2.7.2 DB-EIA清反应
• 1.2.8 一抗特异性验证
• 1.2.8.1 筛选蔗汁中的赖氏细菌
• 1.2.8.2 赖氏菌属模式菌株的恢复培养
• 1.2.8.3 一抗特异性验证
• 2 结果与分析
• 2.1 甘蔗宿根矮化病菌的分离培养和形态学鉴定
• 2.2 甘蔗宿根矮化病菌特异引物的PCR鉴定与产物测序
• 2.3 甘蔗宿根矮化病菌菌液的纯度鉴定
• 2.4 蔗汁中赖氏细菌的筛选结果
• 2.5 甘蔗宿根矮化病菌菌体蛋白提取效果
• 2.6 兔血清的效价测试结果
• 2.7 一抗反应浓度的确定
• 2.8 一抗特异性验证结果
• 第三章 甘蔗宿根矮化病菌分子检测技术（PCR和LAMP）
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒
• 1.2 主要仪器设备和试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 取样
• 1.3.2 DNA提取
• 1.3.3 PCR检测
• 1.3.4 PCR检测灵敏度试验
• 1.3.5 LAMP引物设计与合成
• 1.3.6 LAMP检测条件的优化及检测体系的建立
• 2+浓度的确定'>1.3.7 LAMP反应最佳引物浓度比和最佳Mg²⁺浓度的确定
• 1.3.8 LAMP和PCR检测灵敏度试验
• 2 结果与分析
• 2.1 DNA质量检测
• 2.2 节间蔗汁总DNA和叶片中脉总DNA的PCR检测结果
• 2.3 节间蔗汁总DNA和叶中脉总DNA的PCR检测灵敏度试验
• 2.4 LAMP反应体系的优化
• 2.4.1 内外引物浓度比的确定
• 2+浓度的确定'>2.4.2 Mg²⁺浓度的确定
• 2.5 LAMP检测方法的建立
• 2.6 LAMP和PCR灵敏度比较的结果
• 第四章 讨论与结论
• 1 讨论
• 1.1 关于甘蔗宿根矮化病病原菌分离培养的技术关键
• 1.2 关于血清学检测技术中存在的问题
• 1.3 对PCR检测技术中存在问题的探讨
• 1.4 LAMP检测技术的优越性及技术关键
• 2 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩写词
• 附录Ⅱ 培养基与主要试剂的配制
• 附录Ⅲ 蔗汁中部分赖氏细菌的核苷酸序列
• 致谢