论文摘要
蜜蜂是很多农作物和野生植物的传粉者,在生态和经济中扮演着非常重要的角色,是一种关键的非靶标生物。目前我国人工饲养的蜜蜂主要是意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）,它在植物授粉和维持生态平衡中起着非常重要作用。转基因作物对授粉蜜蜂是否产生不良影响,是人们目前非常关注的焦点问题之一。由于植物和土壤微生物通过根际效应相互制约,相互促进,转基因作物对土壤微生物数量和群落结构多样性的影响是评价转基因作物安全性的重要指标。本文以自主研发的对亚洲玉米螟有高毒力的转cry1Ah基因玉米为实验材料,研究其对意大利蜜蜂中肠细菌群落和土壤微生物群落的影响,为转基因植物的安全性评价体系提供理论依据。主要结果如下:1、实验室内转cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂中肠细菌群落影响分别用转基因玉米花粉糖水、常规玉米花粉糖水、含高浓度质粒糖水、线性cry1Ah片段糖水、糖水空白对照组在实验室内饲喂意大利蜜蜂。两周之后,进行解剖,提取肠道细菌基因组DNA,用免培养技术----变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE）分析五个处理组蜜蜂肠道细菌群落的组成。结果表明,五个处理组DGGE图谱中Shannon’s指数在2.51-2.79之间,群落分布均匀度指数为0.99-1.01,不同处理组蜜蜂中肠细菌群落结构组成差异不显著。对DGGE图谱中的特异条带进行回收克隆测序分析,序列分析结果主要属于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌类（Actinobacteria）。Firmicutes主要由乳杆菌（Lactobacillus sp.）组成,Proteobacteria包含有α-,β-,γ-Proteobacteria,还有部分菌分类地位未确定。2、田间网室转cry1Ah基因玉米花粉对意大利蜜蜂中肠细菌群落影响在田间网室内分别种植转基因玉米和常规玉米。在玉米盛花期时放入蜂群,每个网室放入三箱蜂群,每箱大约10000只蜜蜂。对刚出房的幼虫和工蜂进行标记,对标记后食花粉0天、3天、6天、9天的幼虫分别取样,每个处理组三个重复;对标记后食花粉0天、15天、30天的工蜂分别取样,每个处理组三个重复。提取肠道细菌基因组DNA,用DGGE技术分析不同处理组蜜蜂肠道细菌群落的组成。结果表明,不同天数幼虫处理组DGGE图谱中Shannon’s指数在2.88-3.11之间,群落分布均匀度指数为0.99-1.01,不同天数幼虫蜜蜂中肠细菌群落组成差异不显著。对DGGE图谱中的特异条带进行回收测序,序列分析主要属于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）。不同天数工蜂处理组DGGE图谱中Shannon’s指数在2.60-2.78之间,群落分布均匀度指数为0.99-1.00,不同天数工蜂中肠细菌群落组成没有显著性差异。对DGGE图谱中的特异条带进行回收测序,序列分析主要属于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）和放线菌类（Actinobacteria）。3、转cry1Ah基因玉米对根际土壤微生物群落的影响采用传统的平板计数法分析根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌;同时用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）和BIOLOG方法,对转cry1Ah基因抗虫玉米根部土壤微生物群落结构进行了研究。结果表明:在玉米生长0天、15天、30天、60天、90天、180天土壤样品取样分析,根部可培养的微生物随时间变化有一定的消长,但同一时间内转基因玉米与非转基因玉米二者根部可培养细菌、真菌和放线菌的数量差异不显著。同时变性梯度凝胶电泳的结果显示,在玉米的整个生长期内,根部土壤细菌群落多样性指数为2.40-2.70,群落分布均匀度指数为0.96-0.99;根部土壤真菌群落多样性指数为2.17-2.48,群落分布均匀度指数为0.95-0.99;转基因玉米和常规玉米根部土壤细菌和真菌的群落结构变化差异并不显著。对DGGE图谱中的特异条带进行回收测序,细菌序列分析主要属于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌类（Actinobacteria）和未知菌类（Unknown）;真菌序列分析主要是担子菌（Basidiomycotina）、半知菌（Deuteromycotina）、子囊菌（Ascomycotina）、接合菌（zygomycotina）和一些未知真菌类。在玉米生长0天、30天、90天、180天土壤样品进行BIOLOG分析,结果显示:微生物群落的孔平均颜色变化率值、Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数与对照相比无显著差异。以上结果说明cry1Ah基因的导入并没有对玉米根际土壤群落结构产生显著影响。综上所述,转cry1Ah基因抗虫玉米对有益昆虫和土壤微生物没有不良影响,对生态环境是安全的。这项工作的开展,丰富了转基因抗虫玉米的生态安全性研究数据,为转基因玉米产业化提供了重要的理论依据和技术支撑。