屏障系统微生物气溶胶监测及SPF级实验动物微生物多重PCR分析

论文摘要

屏障系统微生物气溶胶监测是屏障环境监测的重要内容,病原微生物气溶胶可直接影响实验动物的质量。目前,国内动态屏障系统微生物气溶胶监测的研究报道较少,也缺乏动态屏障系统运行情况的评价指标和方法,不利于开展污染源监控；屏障系统内实验动物微生物的检测主要是采用传统的生理生化检验法,检测步骤多、周期长,难以适应对屏障内大量动物感染源的筛查要求。本研究通过监测动态屏障微生物气溶胶的变化规律及屏障系统有害微生物来源,以期为进一步建立屏障系统微生物气溶胶监控体系提供实验参考；通过对多重PCR反应体系的优化,以期建立屏障系统内实验动物微生物多重PCR快速分子检测技术。主要包括2项试验内容。1.实验动物屏障系统微生物气溶胶监测本试验以大型实验动物屏障设施为研究对象,分析屏障设施微生物气溶胶的动态变化规律及其相关影响因素。测定并分析屏障设施各功能区域不同时间及不同工作状态下空气落下菌和直径≥0.3um气溶胶粒子的数量变化。结果表明,屏障系统内空气落下菌与气溶胶粒子在饲养工作后显著升高,喷雾消毒后明显降低；大、小鼠饲育室空气落下菌与气溶胶粒子数在凌晨时明显升高,而兔饲育室在凌晨时间段则较低；清洁走廊和污物走廊在工作状态时细菌含量明显上升,非工作状态时细菌含量一直处于较低的水平。实验动物屏障系统的环境微生物与气溶胶粒子的动态数量变化与动物品种、空气消毒、人员进出及动物室内的饲养操作等有关。实验动物繁殖屏障系统是生产实验动物的主要场所,在屏障系统运行过程中,人员、物品、动物都在不停地出入屏障。物品经过高压消毒或高浓度过氧乙酸喷雾或浸泡进入,空气经过四级过滤进入,动物是由隔离器内传出的SPF级动物,人员经过沐浴后换无菌服进入,但是屏障系统运行之后即很难完全达到SPF级标准,对屏障系统内人流、物流、动物流进行微生物检测,发现饲养人员清洁后仍可从口鼻腔分离到肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌,人员流动可能是造成屏障内污染的主要因素。2.SPF级实验动物易感微生物多重PCR检测技术的建立本试验旨在建立SPF级实验动物易感菌类(主要包括金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌)的多重PCR快速检测方法。根据各细菌特有的毒力基因即金黄色葡萄球菌nuc、肺炎克雷伯菌Phoe、铜绿假单胞菌opr1和肺炎链球菌PspA设计多组特异的引物,通过单一PCR、双重PCR、多重PCR反应筛选,并对每对引物和随机混合引物进行单基因组和多基因组特异性分析,得到特异的引物组合。通过对反应温度Tm值、镁离子浓度、Taq酶浓度进行优化,最终确定4对引物合适的扩增条件为Tm值60.2℃,镁离子浓度3.0mM, Taq酶浓度0.125U/u1。通过对模板基因组梯度稀释,确定了该方法检测的有效灵敏度,经梯度稀释后各细菌检测灵敏度值在金黄色葡萄球菌为22.71pg,肺炎克雷伯杆菌77.67pg,铜绿假单胞杆菌65.63pg,肺炎链球菌45.88pg。在确定优化条件后,利用该方法对感染小鼠粪便及气管样品进行多重PCR分析,有效检测出目标细菌,表明该方法可用于SPF易感细菌的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 简写及缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第—章 微生物气溶胶及实验动物微生物检测技术研究进展
• 1 微生物气溶胶
• 1.1 微生物气溶胶的特征
• 1.2 微生物气溶胶的危害
• 1.3 微生物气溶胶的监测
• 1.4 屏障系统微生物气溶胶特点
• 1.5 影响屏障系统微生物气溶胶的因素
• 1.6 微生物气溶胶的研究现状
• 2 SPF级实验动物微生物检测
• 2.1 SPF级实验动物微生物特征
• 2.2 SPF级实验动物微生物毒力因子
• 2.3 SPF级实验动物易感微生物检测方法
• 2.4 微生物多重PCR检测技术
• 2.5 微生物多重PCR检测技术的评价
• 2.6 微生物多重PCR检测的研究现状
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第二章 实验动物屏障系统微生物气溶胶监测
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 试验仪器
• 1.3 试剂的配制
• 1.4 试验场所环境及饲育方式
• 2 实验方法
• 2.1 样品采集
• 2.2 样品处理
• 2.3 样品生化检测
• 3 结果
• 3.1 落下菌落数量分析
• 3.2 直径≥0.3um气溶胶粒子数量分析
• 3.3 饲养人员携带细菌分析
• 3.4 屏障装置及器具微生物检测结果
• 4 讨论
• 4.1 实验动物屏障系统微生物气溶胶变化规律及原因
• 4.2 实验动物屏障系统微生物气溶胶污染的原因分析
• 参考文献
• 第三章 SPF级实验动物微生物多重PCR分析
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 实验菌株
• 1.2 培养基与试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 试验动物
• 1.5 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 菌种活化与培养
• 2.2 样品DNA提取与检测
• 2.3 PCR扩增
• 2.4 引物检测
• 2.5 多重PCR反应体系的优化
• 2.6. 多重PCR检测方法的应用
• 3 结果
• 3.1 细菌基因组DNA检测结果
• 3.2 细菌基因组DNA浓度测定
• 3.3 各引物扩增结果
• 3.4 扩增片段测序结果
• 3.5 引物特异性检测
• 3.6 多重PCR反应体系的优化
• 3.7 检测样本敏感性检测
• 3.8 感染动物的多重PCR检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 图版及说明
• 致谢