藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究

论文题目: 藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物物理学

作者: 武栋

导师: 赵开弘

关键词: 藻胆蛋白,体外重组,裂合酶,酶动力学,缺失突变,定点突变,化学修饰

文献来源: 华中科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族。藻胆色素生物合成的最后一步为色素与脱辅基藻胆蛋白的连接。体内,藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。目前已知藻红蓝蛋白裂合酶PecE/F 催化藻蓝色素PCB 异构化形成PVB 并与脱辅基蛋白PecA 连接; 藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F 催化藻蓝色素PCB 与脱辅基蛋白CpcA 的连接。PecE/F 与CpcE/F 之间有20~40%的相似性,对这两个酶的催化机理的研究还是空白。本研究通过比较两者的氨基酸序列,构建缺失突变体、定点突变体和使用化学修饰的方法对其功能区域及功能氨基酸残基进行分析。首次研究了PecE 和PecF 催化反应中的辅助因子和酶动力学。研究表明:巯基乙醇(5mmol/L)和Mg2+(5mmol/L)、Mn2+(3mmol/L)是催化反应所必需的,1%Triton X-100 可提高反应效率。磷酸钾和Tris 混合缓冲液可以提高蛋白的溶解性和减少其对金属离子的的结合,有利于催化反应。酶动力学研究表明催化反应遵循顺序反应机制,在催化反应中:PecE 主要催化PCB 与脱辅基蛋白的连接,PecF 主要催化色素PCB 异构化形成藻紫胆素PVB。PCB 与脱辅基蛋白PecA 在无酶催化下形成共价连接产物:31-Cys-PecA-PCB,但不能作为PecE/F 的底物被催化形成正确的产物:31-Cys-PVB-PecA。利用镍离子鳌合亲和层析提纯,证明PecE 和PecF 之间可形成复合物。在序列分析和实验室已经研究的PecE/F 缺失突变体的基础上,构建了缺失突变体PecE(1-267)和PecF(57-212),前者酶活性无变化,PecF(57-212)的研究表明PecF中4 个独特的连续组氨酸残基对酶活性没有贡献。PecE 和PecF 中4 个高同源性的半胱氨酸残基进行了定点突变,研究了突变体PecE(C48Q)、PecE(C91L)、PecE(C161L)和PecF(C122L)在三种不同状态(未提纯,提纯,尿素变性复性)下的酶活性。酶动力学研究表明:PecE 的第48 位半胱氨酸残基与底物结合有关,第91 位半胱氨酸残基参与酶催化和底物结合; PecF 第122 位半胱氨酸残基位于酶活性中心,对它的突变导致了酶活性丧失。PecE 和PecF 都可以与底物PCB 结合,半胱氨酸残基的突变导致了PecE 突变体结合PCB 能力的下降和PecF(C122L)光谱的红移。PecE/F 与PCB的结合在紫外光激发下显示荧光,在尿素变性条件下吸收光谱范围在550~660 nm 之

论文目录:

摘要

Abstract

1 序言

1.1 藻胆体

1.2 藻胆蛋白

1.3 藻胆蛋白的光谱性质

1.4 藻胆蛋白基因的表达和调控

1.5 连接多肽

1.6 藻胆色素

1.7 藻胆色素的生物合成

1.8 藻胆蛋白的生物合成

1.9 本课题的研究意义和展望

2 藻红蓝蛋白裂合酶体外重组体系的优化及性质研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 裂合酶PecE/F 和脱辅基蛋白PecA 的提纯

2.4 体外重组体系的优化

2.5 裂合酶PecE/F 的催化动力学

2.6 两个亚基PecE 和PecF 的相互作用

2.7 本章小结

3 藻红蓝蛋白裂合酶中功能氨基酸残基的研究

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 PecE 和PecF 氨基酸序列的分析和同源性比较

3.4 PecE 和PecF 缺失突变体的构建和研究

3.5 PecE 和PecF 中半胱氨酸残基突变体的构建和研究

3.6 PecE 和PecF 突变体的酶动力学分析

3.7 PecE 和PecF 与底物色素PCB 的结合

3.8 PecE 和PecF 及其突变体之间复合物的形成

3.9 本章小结

4 藻红蓝蛋白裂合酶化学修饰的研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 PecE 和PecF 中氨基酸残基的化学修饰

4.4 PecE 和PecF 的功能基团及其功能的总结

4.5 本章小结

5 藻蓝蛋白裂合酶CpcE

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 CpcE 和CpcF 突变体的构建和表达

5.4 CpcE 和CpcF 及其突变体的表达及提纯

5.5 CpcE/F 及其突变体蛋白酶活性的测定

5.6 CpcE/F 及其定点突变体蛋白的酶动力学研究

5.7 CpcE/F 缺失突变体对EF 复合物的影响

5.8 CpcE/F 与PecE/F 之间的交叉重组的研究

5.9 本章小结

6 藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F 功能基团的研究

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.3 结果与讨论

6.4 CpcE,CpcF 及其复合物CpcEF 与PCB 的结合

6.5 结合在CpcE 和CpcF 上的PCB 向apo-CpcA 的转移

6.6 藻红蓝蛋白裂合酶PecE/F 与CpcE/F 性质的比较

6.7 本章小结

7 结论与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的学术论文

附录2 缩略词(Abbreviation)

附录3 附图

发布时间: 2006-04-05

参考文献

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