MicroRNA-153在阿尔茨海默病模型鼠发病机制中的作用

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经退行性变,是老年痴呆的主要类型,病理表现以老年斑、神经纤维缠结为主。随着现代社会人口老龄化趋势的迅速增长,老年性疾病特别是老年痴呆发病率呈上升趋势,严重影响老年人的生存质量,然而,AD是一种多因素的复杂性疾病,其病因及发病机制迄今尚不明确。MicroRNA （miRNA）是一类长约22个核苷酸的内源性小分子RNA,通过抑制转录后mRNA的翻译而调控蛋白表达。越来越多的研究表明在多种疾病的发生中miRNA均发挥着重要作用。其中,miRNA参与AD发病机制的文章也日见报道,然而,相关方面的研究尚处于初步阶段,进一步探讨AD发病过程中异常表达的miRNA及其作用不仅可为AD发病机制提供新的诠释且有望为治疗提供新的途径。APP （Amyloid protein precursor）是Aβ肽的前体蛋白,其表达水平的增加可直接导致Aβ肽生成增多从而成为AD的主要致病基因。APP属于一类高度保守的跨膜糖蛋白家族,哺乳动物的该家族成员还包括有APLP1和APLP2。多方研究证实APLP2在AD的发病机制中也起着重要作用。本课题通过对APPswe/PSΔE9双转基因小鼠脑组织miRNA表达谱的分析发现,在该AD模型小鼠体内存在有miR-153的异常表达。定量PCR检测进一步证实了在3月龄及9月龄AD小鼠脑内,miR-153的表达显著降低。经数据库预测,在APP和APLP2的3’UTR区均存在一miR-153的结合位点,荧光素酶报告基因检测试验分别证明了这一位点的有效性。Western-blot检测APPswe/PSΔE9小鼠脑内APLP2蛋白表达显示：3月龄及9月龄AD小鼠脑APLP2的表达显著增加。为进一步验证miR-153对APP和APLP2的靶向调控作用,构建了稳定高表达miR-153的SH-SY5Y稳转细胞系,检测稳转细胞系内靶基因的表达,结果显示APP/APLP2的蛋白表达显著降低。同时,定量PCR检测显示其mRNA水平也有一定程度的降低,表明miR-153在抑制APP/APLP2 mRNA翻译的同时也可影响其稳定性。反之,使用miRNA inhibitor抑制M17细胞内源性表达的miR-153后,细胞内APLP2蛋白水平显著增加。将miR-153表达载体或阴性对照载体与含有全长3’UTR的APP表达载体共转染入HEK-293T细胞内,转染后48h检测细胞内APP蛋白及mRNA的表达,结果显示与稳转细胞试验相一致,miR-153与APP质粒共转染组APP的蛋白及mRNA水平较阴性对照与APP质粒共转染组显著降低。将miR-153与APP质粒共转染后24h的细胞经mir-153 inhibitor或inhibitor control处理,48h后再检测APP的蛋白表达,结果表明,mir-153 inhibitor处理组较inhibitor control组显著增加,反向证明了miR-153的表达调控作用。为进一步体内验证miR-153对APP/APLP2的调控作用,构建了miR-153转基因小鼠及双突变的、含全长APP-3’UTR的人AppLon/Swe转基因小鼠,并将这两种小鼠杂交获得了miR-153/APPLon/Swe双阳小鼠。检测miR-153转基因小鼠脑内的APLP2蛋白表达,结果显示与对照相比,其APLP2蛋白水平显著降低。同时对miR-153/APPLon/Swe双阳小鼠脑内APP的蛋白表达检测结果显示,与APPLon/Swe单阳小鼠相比,其APP蛋白水平也在一定程度上有所降低。为验证在脑正常发育过程中miR-153对APP/APLP2的调控作用,检测了妊娠17.5天-12月龄野生C57小鼠脑内miR-153及APP/APLP2的蛋白和mRNA表达,结果显示,在该发育阶段内miR-153表达与APP/APLP2的蛋白水平呈反向相关趋势,而相对于APP/APLI的蛋白水平而言,其mRNA水平变化不显著,表明在正常鼠脑发育过程中,其表达受miR-153的调控。因Aβ42肽和氧化应激在AD的发病机制中起着重要作用,且目前有文献报道两者均可影响细胞内miRNA的表达,为验证其对miR-153表达水平的影响,将M17细胞分别经Aβ42和H2O2处理后,在不同时间检测其miR-153及APLP2的蛋白表达,结果显示,Aβ42和H2O2处理后可导致miR-153表达水平的改变,且其变化与作用时间相关。与之相应,随着miR-153水平的波动,APLP2的蛋白表达呈相反的变化趋势。表明Aβ42肽和氧化应激可影响miR-153的表达,从而导致其靶基因表达水平的改变。本课题研究表明,在APPswe/PSΔE9模型鼠发病过程中miR-153的表达异常降低。miR-153可靶向结合于APP和APLP2的3’UTR区抑制其蛋白表达,从而在AD的发病机制中起到一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• AD的发病机制
• 1. 基因突变
• 2. Aβ淀粉样肽假说
• 3. Tau蛋白假说
• 4. 胆固醇代谢异常
• 5. 氧化应激
• MicroRNA
• 1. miRNA的基因定位及表达调控
• 2. miRNA的生物合成
• 3. miRNA靶基因的鉴定
• 4. miRNA研究新进展
• miRNA与神经系统
• 1. miRNA在神经系统中的表达
• 2. miRNA和神经系统的分化发育
• 3. miRNA和脑的生理功能
• mciorRNA与AD
• 1. AD患者脑内miRNA表达谱的改变
• 2. miRNA调控AD致病基因的表达
• APP蛋白家族
• 展望
• 第一部分 microRNA在阿尔茨海默病中的作用研究
• 一. 材判
• 1. 实验动物
• 2. 主要生化试剂
• 3. 主要溶液配置
• 4. 主要仪器设备
• 二. 实验方法
• 1 APPswe/PS△E9转基因小鼠模型的制备和鉴定
• 2. MicroRNA芯片
• 3. Real-Time Reverse Transcriptase （RT） PCR
• 4. miR-153表达载体的制备
• 5. miR-153稳转细胞系的建立和鉴定
• 6. 瞬时共转染
• 7. 氧化应激及Aβ肽毒性损伤细胞模型的制作
• 8. miR-153稳转细胞系增殖活性的检测
• 9. miR-153稳转细胞系凋亡水平的检测
• 10. miR-153靶基因的预测
• 11. APP-3’UTR、APLP2-3’UTR荧光素酶报告载体的构建
• 12. 荧光素酶活性检测实验
• 13. 免疫印迹（Western blot）
• 14. 统计学分析
• 三.结果
• 1. APPswe/PSΔE9转基因鼠鼠尾鉴定结果
• 2. microRNA芯片检测结果
• 3. 组织及细胞RNA质量的鉴定
• 4. Real-time PCR检测AD小鼠脑组织中miR-153的表达
• 5. miR-153靶基因的预测
• 6. miR-153与靶基因3’UTR区的相互作用
• 7. APPswe/PSΔE9转基因小鼠脑内APP、APLP2的表达
• 8. miR-153对APP和APLP2表达水平的调控作用
• 2O₂对miR-153表达水平的影响'>9. Aβ42肽和H₂O₂对miR-153表达水平的影响
• 10. 高表达miR-153对下游信号分子的影响
• 四.讨论
• 1. miRNAs与AD发病机制的研究现状
• 2. APPswe/PSAE9双转基因鼠脑内miR-153的异常表达
• 3. miR-153靶基因的预测及鉴定
• 4. APP蛋白家族与AD
• 5. miRNAs的表达调控
• 6. miR-153对靶基因下游信号分子的影响
• 第二部分 miR-153转基因小鼠的建立和分析
• 一.实验方法
• 1. miR-153转基因小鼠的制备
• 2. 转基因阳性鼠基因型的PCR鼠尾鉴定
• 3. Real-time PCR检测转基因鼠miR-153的表达
• 4. Western-blot检测miR-153靶基因的表达
• 二.结果
• 1. PCR鼠尾鉴定miR-153转基因小鼠
• 2. Real-time PCR检测转基因鼠miR-153的表达水平
• 3. 转基因鼠脑内miR-153靶蛋白表达水平的检测
• 4. 脑生理发育过程中miR-153与APP、APLP2的共表达
• 三.讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 缩写表
• 致谢