喹啉降解反应器菌群内整合子检测和耐药性分析

论文摘要

污染环境中普遍存在着耐药性菌株,其中许多细菌具有多重耐药性,这与环境选择压力密切相关。大量研究表明,水体环境中细菌的耐药性主要来自于医疗机构排放的废水,其次来自于生活废水。在生活和医疗污水处理厂的活性污泥中,抗性菌株大量存在,但在工业废水处理环境中却未见抗生素抗性方面的报道。在细菌耐药基因的水平转移过程中,整合子-基因盒系统发挥着重要作用。整合子是在细菌中发现的一种可移动性基因元件,它通过位点特异性重组来捕获并表达外源性基因盒。本实验室建立的以喹啉为唯一碳源的反硝化反应器可以成功、稳定地去除合成废水中的喹啉和硝酸盐。本文运用PCR技术及克隆文库方法,对该生态系统中携带功能基因盒的整合子的存在情况及其功能进行了分析。结果发现,在该反硝化喹啉降解反应器的生物膜群落中,整合子携带着丰富多样的基因盒,大小在200-1000bp之间。它们大部分编码可能与抗生素耐药性相关的蛋白,主要是氨基糖苷类耐药基因（如aadA基因）。也带有与工业废水或焦油池的整合子研究文献所报道的相近的基因（如FldF基因）,它们可能与芳香族化合物降解有关。还有一些基因盒中携带的基因未有已知相似序列,其功能未知。由于在废水处理反应器中检出的基因盒中,耐药基因盒的类型和数量较多,我们进一步对该反应器生物膜中的35株功能优势菌进行了耐药性测定、质粒谱和泛宿主性质粒特性分析,以期了解其中细菌菌株耐药性的状况及其产生原因。试验结果表明,有42.9%的菌株存在耐药性,28.6%的菌株有多重耐药性。分离菌株对5种抗生素的耐药率分别为:氨苄青霉素28.6%、卡那霉素22.9%、氯霉素20.0%、链霉素22.9%,对利福平则全部敏感。对15株抗性菌株的质粒谱分析结果并未显示出菌株质粒谱与耐药性有明显相关性,质粒在细菌的基因水平转移中的作用还需要更深入探讨。此外,未能通过Inc群特异性PCR方法在抗性菌中得到泛宿主性质粒的特征条带,可能泛宿主质粒并非该反应器群落中主要的水平基因转移途径。本研究所分析的喹啉废水生物反应器的环境中并不存在抗生素选择压力,种子污泥也来自于一个几乎没有抗生素选择压力的焦化废水厂,群落中的功能优势菌株却普遍具有抗生素耐药性,而且群落基因组的整合子中较普遍携带有抗生素抗性基因的基因盒。这一现象还未曾见报道,其成因值得今后进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 环境细菌耐药性的研究现状
• 1.1.1 环境细菌普遍存在耐药性
• 1.1.2 细菌耐药性的产生机制
• 1.1.3. antibiotic resistome 与antibiotic extended resistome
• 1.2 水平基因转移
• 1.2.1 水平基因转移的概念
• 1.2.2 水平基因转移的作用
• 1.2.3 水平基因转移的方式
• 1.3 整合子
• 1.3.1 整合子的概念
• 1.3.2 整合子的结构
• 1.3.3 整合子的分类
• 1.4 基因盒
• 1.4.1 基因盒的结构
• 1.4.2 基因盒的种类
• 1.4.3 基因盒的来源
• 1.4.4 基因盒的移动和表达
• 1.5 泛宿主质粒
• 1.5.1 泛宿主质粒的概念
• 1.5.2 不相容性的检测
• 1.5.3. Inc群质粒
• 1.6 整合子的检测方法
• 1.7 污水处理环境中耐药基因及整合子的研究
• 1.8 本文涉及的分子生态学研究方法
• 1.8.1 克隆文库技术
• 第二章 喹啉降解群落中整合子的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 喹啉反应器反应装置及样品采集
• 2.2.2 反应器喹啉去除率检测（分光光度法）
• 2.2.3 生物膜样品的预处理与 DNA 提取
• 2.2.4 反应器生物膜样品整合子 PCR 分析
• 2.2.5 转化和构建克隆文库
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 反应器的喹啉去除率检测
• 2.3.2 生物膜样品总 DNA 提取
• 2.3.3 两种 PCR 扩增体系的比较
• 2.3.4. First gene cassettes 扩增及纯化结果
• 2.3.5. Gene cassettes 扩增及纯化结果
• 2.3.6 序列比对和分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 携带耐药基因盒和芳香族污染物降解基因盒的整合子的发现
• 2.4.2 部分基因盒的功能尚不明确
• 2.4.3 运用两对引物进行 PCR 方法构建克隆文库的比较
• 2.5 本章小结
• 第三章 喹啉降解微生物群落优势微生物的耐药性测定和质粒谱分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株来源
• 3.2.2 培养基和培养条件
• 3.2.3 菌株天然耐药性鉴定
• 3.2.4 抗性菌株质粒谱分析
• 3.2.5 抗性菌株泛宿主性质粒分析
• 3.2.6 序列比对和分析
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 菌株天然耐药性鉴定
• 3.3.2 抗性菌株质粒谱分析
• 3.3.3 抗性菌株泛宿主性质粒分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 水体环境中耐药基因的主要分布及成因
• 3.4.2 从一个几乎不含抗生素选择压力的反应器中发现了菌株耐药性
• 3.4.3 对耐药菌株的质粒特性研究仍需深入
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 附录1 溶液试剂及培养基的配制
• 附录2 实验中所用的仪器设备
• 附录3 缩写和全称
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已（待）发表或录用的论文