柱状黄杆菌胞外和外膜蛋白及草鱼鳃粘液的蛋白质组学研究

论文摘要

柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）引起的柱形病是一种全球性的危害多种鱼类的细菌性鱼病,在我国流行广且危害严重的细菌性烂鳃病的病原就是柱状黄杆菌。本研究以柱状黄杆菌和草鱼（Ctenopharyngodon idellus）为对象,以蛋白质组学技术为手段,用比较蛋白质组学的方法研究了柱状黄杆菌强毒株和弱毒株差异表达的胞外蛋白,研究了柱状黄杆菌外膜蛋白和草鱼鳃粘液的蛋白质组。浸泡攻毒实验表明F. columnare G4R3和G18分别是强毒株和弱毒株,对数生长后期的G4R3和G18胞外蛋白的双向电泳图谱显示出34个差异表达的蛋白点,利用串联质谱分析,7个蛋白点代表滑动蛋白K,腺酐甲硫氨酸合成酶和假定的膜蛋白等3个蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子。柱状黄杆菌的外膜蛋白（outer membrane proteins, OMPs）经SDS-PAGE初步分离,用鸟枪法蛋白质组学分析方法,鉴定出757个蛋白,其中有110个蛋白得到可信鉴定。在这757个蛋白中,有30个与本实验室以前利用抗OMPs抗体筛选到的编码与膜相关的抗原性蛋白相同,如lipid A disaccharide syntheatase, outer membrane receptor proteins, alpha-amylase, glucosamine N-aclrytransferase, K+-transporter, aminopeptidase和aspartate 1-decarboxylase等。草鱼鳃粘液经过凝胶过滤层析结合传统的双向凝胶电泳,共分离了406个蛋白点,通过质谱分析,鉴定了其中的99个蛋白点。其中,凝集素样蛋白、转铁蛋白、蛋白酶体、组蛋白样蛋白等在鱼类的免疫反应中可能起着重要作用。综上所述,本研究用比较蛋白质组学的方法鉴定了胞外蛋白中3个可能的毒力相关蛋白。用鸟枪法蛋白质组学方法获得了柱状黄杆菌外膜蛋白的全蛋白表达谱,用双向电泳结合质谱分析鉴定了草鱼鳃粘液中的99个蛋白点。为认识柱状黄杆菌的毒力因子及进一步研究OMPs的功能以及筛选保护性抗原、毒力相关的蛋白以及疫苗的研制奠定了基础,为了解鱼类鳃粘液的组成成分以及鱼类粘膜免疫的组成与作用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 第一章 文献综述：蛋白质组学研究技术及其在病原菌研究中的应用
• 1. 蛋白质组和蛋白质组学的概念
• 2. 蛋白质组学研究技术
• 2.1 蛋白质组分离技术
• 2.2 蛋白质组鉴定技术
• 2.2.1 电喷雾（ESI）质谱
• 2.2.2 基质辅助激光解析（MALDI）质谱
• 2.2.3 一些新的鉴定技术
• 2.3 蛋白质相互作用的研究技术
• 2.3.1 酵母双杂交
• 2.3.2 噬菌体展示
• 2.3.3 生物分子相互作用分析质谱
• 2.3.4 以质谱为基础的蛋白质相互作用研究技术
• 3. 蛋白质组学在病原菌研究中的应用
• 3.1 细菌蛋白质组数据库
• 3.2 病原菌致病机理的研究
• 3.3 抗原性的研究
• 3.4 药物抗性的研究
• 4. 本研究的目的及内容
• 第二章 柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白的比较蛋白质组学研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 菌株和培养条件
• 50的测定'>2.2. LD₅₀的测定
• 2.3 菌落形态观察
• 4R3和G₁₈的生长曲线的测定'>2.4 菌株G_4R3和G₁₈的生长曲线的测定
• 2.5 细菌胞外蛋白（ECPs）的制备
• 2.6 胞外蛋白的SDS-PAGE
• 2.7 双向电泳
• 2.8 胶内酶解
• 2.9 基质辅助的激光解吸离子化-飞行时间质谱（matrix assisted 1aser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）及其串联质谱(MALDI-TOF MS析
• 2.10 液相层析-离子阱质谱（LC-MS）分析
• 3. 结果
• 4R3和G₁₈的毒力评价'>3.1. G_4R3和G₁₈的毒力评价
• 3.2. 菌落形态
• 4R3和G₁₈的ECPs的SDS-PAGE'>3.3. G_4R3和G₁₈的ECPs的SDS-PAGE
• 4R3和G₁₈的ECPs的双向电泳'>3.4. G_4R3和G₁₈的ECPs的双向电泳
• 3.5. MALDI-TOF MS 和MALDI-TOF以及 ESI-MS 鉴定差异表达的蛋白
• 4. 讨论
• 第三章 柱状黄杆菌的外膜蛋白的蛋白质组学研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 菌株和培养条件
• 2.2 柱状黄杆菌外膜蛋白的提取
• 2.3 外膜蛋白的SDS-PAGE
• 2.4 胶内酶解
• 2.5 反相HPLC MS/MS Shotgun 分析
• 2.6 蛋白质鉴定和数据分析
• 3. 结果
• 3.1 外膜蛋白的SDS-PAGE
• 3.2 外膜蛋白的鸟枪法蛋白质组学分析
• 4. 讨论
• 第四章草鱼鳃粘液的蛋白质组学研究
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 草鱼来源与饲养
• 2.2 鳃粘液的收集与保存
• 2.3 凝胶过滤层析
• 2.3.1 凝胶过滤层析柱的制备
• 2.3.2 粘液样品的凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography,GFC）
• 2.3.3 各组分的一维凝胶电泳
• 2.4 鳃粘液样品的双向电泳
• 2.4.1 样品裂解
• 2.4.2 双向电泳
• 2.5 图像的采集和双向电泳图谱的分析
• 2.6 质谱鉴定
• 2.6.1 胶内酶解
• 2.6.2 基质辅助的激光解吸离子化-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption mass spectrometry, MALDI-TOF MS） 及其串联质谱（MALDI-TOF/TOF MS）分析
• 2.6.3 液相层析-离子阱质谱（LC-MS）分析
• 3. 结果
• 3.1 凝胶过滤层析柱的检测
• 3.2 凝胶过滤层析对粘液样品分级
• 3.3 粘液样品的双向电泳
• 3.4 粘液样品的质谱鉴定
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表和待发表的论文
• 致谢