甲酸脱氢酶基因的克隆表达及重组菌的高密度培养

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甲酸脱氢酶属于D-2-羟基酸脱氢酶类,它可以将甲酸氧化为CO2,同时将NAD+还原为NADH。NAD+依赖型的甲酸脱氢酶（FDH）广泛存在于自然界中,目前已经在多种细菌和真菌中发现了FDH,甚至在一些哺乳动物细胞中也发现了甲酸脱氢酶基因,例如鼠类和人类。甲酸脱氢酶在工业生产中有着重要应用,常用于工业生产中的辅酶再生体系。由于从自然界天然微生物中提取FDH成本比较高,目前对甲酸脱氢酶研究的主要方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,通过重组菌的高效表达获得酶。本文首先利用YPD培养基,在30℃培养了含有NAD+依赖型的甲酸脱氢酶基因的博伊丁假丝酵母,提取基因组,并以此基因组为模板进行PCR扩增,得到大小约为1.1kb的基因片段。将此小片段和T载体pMD18-T Simple Vector连接,得到重组质粒载体pMD18-T-fdh。双酶切表达载体pET28a（+）和pMD18-T-fdh,经T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pET28a（+）-fdh。将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中进行表达,经SDS-PAGE电泳验证蛋白表达。重组菌构建成功后,对重组菌的发酵条件进行了优化。得到了优化培养基:Na2HPO4·7H2O 13g/L,NaCl 0.5g/L,KH2PO43g/L,NH4Cl 3.5g/L,MgSO40.2g/L,葡萄糖10g/L,微量元素2ml/L;培养条件为:摇瓶装液量30ml/250ml,初始pH值为7.5,接种量为4%;诱导条件为:对数生长前期开始诱导,IPTG最终浓度为0.4mM,诱导温度为28℃,诱导后培养时间为6h。甲酸脱氢酶粗酶液酶比活达到0.13U/mg。最后在15L发酵罐上对重组菌进行了放大培养,在分批补料发酵方式下,通过补加葡萄糖,菌体的OD600最高达到83,发酵液中FDH酶总活达到11.9U/ml。在pH-stat法补料发酵方式下,菌体最终OD600达到98,发酵液中FDH酶总活力达到12.1U/ml。

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第一章文献综述

1.1 甲酸脱氢酶简介

1.1.1 甲酸脱氢酶的来源

+依赖型甲酸脱氢酶的结构'>1.1.2 NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶的结构

1.1.3 NAD+依赖型甲酸脱氢酶的理化性质

1.1.4 对甲酸脱氢酶的酶学改造研究

+依赖型FDH的主要生产方法'>1.1.5 NAD⁺依赖型FDH的主要生产方法

+依赖型FDH的应用'>1.1.6 NAD⁺依赖型FDH的应用

1.2 大肠杆菌表达系统

1.3 高密度培养技术

1.3.1 高密度发酵概述

1.3.2 影响大肠杆菌高密度培养的主要因素

1.3.3 补料策略

1.4 选题意义及研究目的

1.4.1 选题意义

1.4.2 研究目的

第二章甲酸脱氢酶重组菌构建

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 菌种与质粒

2.2.2 工具酶及试剂盒

2.2.3 培养基

2.2.4 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 DNA提取方法

2.3.2 PCR方法

2.3.3 DNA检测及胶回收

2.3.4 感受态细胞的制备及转化

2.3.5 重组质粒的构建

2.3.6 重组菌的构建

2.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.4 结果与讨论

2.4.1 Candida boidinii基因组提取

2.4.2 甲酸脱氢酶（FDH）基因的扩增和鉴定

2.4.3 TA克隆及鉴定

2.4.4 重组质粒构建

2.4.5 重组菌的构建

2.4.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白表达

2.5 小结

第三章重组大肠杆菌表达甲酸脱氢酶培养条件的初步研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 实验仪器与试剂

3.2.4 培养条件

3.2.5 NADH浓度测定

3.2.6 蛋白质浓度测定方法

3.2.7 甲酸脱氢酶酶活检测方法

3.2.8 酶催化反应曲线测定

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 重组菌在种子瓶中的生长曲线

3.3.2 重组菌培养基条件的优化

3.3.3 培养环境条件优化

3.3.4 诱导条件的选择

3.4 小结

第四章重组菌在发酵罐中的扩大培养

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 菌种

4.2.2 培养基

4.2.3 培养条件

4.2.4 主要实验仪器

4.3 分析方法

4.3.1 pH值和溶氧

4.3.2 菌体密度

4.3.3 葡萄糖浓度测定

4.3.4 酶活和酶比活力测定

4.4 结果与讨论

4.4.1 分批补料发酵

4.4.2 pH-stat法补料发酵

4.5 小结

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 本文创新之处

5.3 展望

参考文献

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