热加工、辐照及超高压微射流对花生过敏原Ara h 6结构与抗原性的影响

论文摘要

花生是人类最优质的植物蛋白来源之一,也是八大类容易引起过敏的食物之一。近年来,由于花生过敏患者数量呈明显上升的趋势,探索降低花生过敏性的研究受到了人们的高度重视。Ara h 6是花生主要过敏原之一,可引发63%的花生过敏患者发生过敏反应。因此,本论文工作以Ara h 6为对象,研究加工对花生过敏原结构及抗原性的影响,旨在阐明Ara h 6经加工后的结构变化与其抗原性的关系。论文开展的研究工作包括花生过敏原Ara h 6的纯化与提取、兔抗Ara h 6多克隆抗体的制备、热加工和辐照及超高压微射流对花生过敏原Ara h 6结构与抗原性的影响。研究的主要方法、结果及结论如下。1.采用阴离子交换层析法从新鲜花生仁中分离纯化花生过敏原Ara h 6,并通过SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF/MS质谱对分离所得目标蛋白进行鉴定。结果表明,该方法分离所得的Arah 6的纯度大于95%,得率为18.3%。该方法简单、易操作、重现性好,适用于实验室少量制备。2.以纯化的Ara h 6为抗原,免疫新西兰大白兔,获得抗Ara h 6的兔多克隆抗体,通过间接ELISA和免疫印迹方法鉴定其效价和特异性,结果表明,该抗体效价为1：100,000,特异性强,可满足抗原性评估的要求。3.对Ara h 6纯化蛋白和花生粗蛋白分别进行不同的热处理,通过SDS-PAGE电泳、圆二色谱、紫外光谱、荧光探针光谱检测Ara h 6热加工后的结构变化,并采用间接ELISA方法测定热加工后Ara h 6纯化蛋白和花生粗蛋白的抗原性变化。结果表明,Ara h 6经热处理后,其最大紫外吸光值增大,疏水性增强,各类型二级结构相互转变,且115℃热处理可使Ara h 6形成多聚体；抗原性分析结果则表明,随着加热程度的增强,Ara h 6纯化蛋白和粗蛋白的抗原性降低。由此推断,Ara h 6蛋白经热加工后的构象变化导致了它的抗原性降低,蛋白构象对于Ara h 6蛋白的抗原性起着关键的作用。4.对Ara h 6纯化蛋白和花生粗蛋白分别进行辐照和超高压微射流处理,通过SDS-PAGE电泳、圆二色谱、紫外光谱、荧光探针光谱检测Ara h 6加工后的结构变化,并采用间接ELISA方法测定加工后Ara h 6纯化蛋白和花生粗蛋白的抗原性变化。结果表明,Ara h 6经辐照或超高压微射流处理后,蛋白质分子展开,疏水基团暴露,二级结构改变,且辐照处理可使Ara h 6形成多聚体；间接ELISA检测结果表明,随着辐照剂量的升高或超高压微射流处理压力的增加,Ara h 6纯化蛋白和粗蛋白的抗原性降低。由此推断,辐照和超高压微射流处理破坏了Ara h 6蛋白的结构特征,导致该蛋白抗原性降低,该蛋白的结构稳定性对其抗原性具有至关重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第1章 引言
• 1.1 花生过敏原
• 1.1.1 Ara h1
• 1.1.2 Ara h2
• 1.1.3 Ara h3
• 1.1.4 Ara h6
• 1.1.5 其它花生过敏原
• 1.2 加工对食物过敏原的影响
• 1.2.1 热加工对过敏原的影响
• 1.2.2 非热加工对过敏原的影响
• 1.2.3 加工对花生过敏原的影响
• 1.3 研究的目的、意义和研究内容
• 1.3.1 研究目的与意义
• 1.3.2 研究内容
• 第2章 花生过敏原Ara h 6的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与设备
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 花生脱脂
• 2.3.2 蛋白浸提
• 2.3.3 花生过敏原Ara h 6的纯化
• 2.3.4 SDS-PAGE检测所分离蛋白的纯度
• 2.3.5 蛋白质含量的测定
• 2.3.6 质谱鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 花生蛋白粗提物的电泳分析
• 2.4.2 离子交换层析分离纯化花生过敏原Ara h 6
• 2.4.3 花生过敏原Ara h 6的质谱鉴定结果
• 2.4.4 花生过敏原Ara h 6纯化得率
• 2.5 讨论
• 2.5.1 花生过敏原蛋白的粗提
• 2.5.2 离子交换层析分离纯化花生过敏原Ara h 6
• 2.5.3 花生过敏原Ara h 6的鉴定
• 2.6 小结
• 第3章 抗花生过敏原Ara h 6多克隆抗体的制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.2 主要仪器与设备
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 抗原的准备
• 3.3.2 免疫方案
• 3.3.3 血清的分离
• 3.3.4 最佳抗原包被浓度和酶标二抗最佳稀释度的确定
• 3.3.5 间接ELISA测抗体效价
• 3.3.6 免疫印迹
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 方正滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳二抗稀释度
• 3.4.2 免疫过程中抗体效价的变化
• 3.4.3 免疫印迹鉴定抗体特异性
• 3.5 讨论
• 3.5.1 抗花生过敏原Ara h 6多克隆抗体的制备
• 3.5.2 抗体的效价鉴定
• 3.5.3 抗体特异性
• 3.6 小结
• 第4章 热加工对花生过敏原Ara h 6结构及抗原性的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 试剂与材料
• 4.2.2 主要仪器与设备
• 4.2.3 溶液的配制
• 4.3 方法
• 4.3.1 样品的制备
• 4.3.2 热处理
• 4.3.3 SDS-PAGE电泳检测
• 4.3.4 圆二色谱分析
• 4.3.5 紫外光谱分析
• 4.3.6 荧光光谱分析
• 4.3.7 抗原性检测
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 热处理前后Ara h 6的电泳分析
• 4.4.2 热加工对Ara h 6二级结构的影响
• 4.4.3 热加工对Ara h 6紫外光谱的影响
• 4.4.4 热加工对Ara h 6疏水性的影响
• 4.4.5 热加工对Ara h 6抗原性的影响
• 4.5 讨论
• 4.5.1 热加工对花生过敏原Ara h 6结构的影响
• 4.5.2 热加工对花生过敏原Ara h 6抗原性的影响
• 4.6 小结
• 第5章 非热加工对花生过敏原Arah6结构及抗原性的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与设备
• 5.2.1 试剂与材料
• 5.2.2 主要仪器与设备
• 5.2.3 溶液的配制
• 5.3 方法
• 5.3.1 样品的制备
• 5.3.2 非热加工处理
• 5.3.3 SDS-PAGE电泳检测
• 5.3.4 圆二色谱分析
• 5.3.5 紫外光谱分析
• 5.3.6 荧光光谱分析
• 5.3.7 抗原性检测
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 非热处理前后Ara h 6的电泳分析
• 5.4.2 非热加工对Ara h 6二级结构的影响
• 5.4.3 非热加工对Ara h 6紫外光谱的影响
• 5.4.4 非热加工对Ara h 6疏水性的影响
• 5.4.5 非热加工对Ara h 6抗原性的影响
• 5.5 讨论
• 5.5.1 非热加工对花生过敏原Ara h 6结构的影响
• 5.5.2 非热加工对花生过敏原Ara h 6抗原性影响
• 5.6 小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 本研究创新点
• 6.3 建议与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间研究成果