有机磷农药降解酶发酵条件的优化及酶性质的研究

论文摘要

本文对基因工程菌E.coliBL2l（DE3）/pET30a-mpd的发酵条件进行了优化。通过单因素实验考察了培养基中碳源、氮源、磷酸盐的种类和浓度，发酵液初始pH值、接种量、装液量、发酵温度以及乳糖添加量和诱导时间对有机磷农药降解酶的影响，从中得出利于降解酶合成的上述因素的组成为：甘油为碳源、酵母粉和蛋白胨为氮源、初始pH值8.0，接种量5％，装液量100mL/500mL三角瓶，温度25℃，乳糖在发酵后4小时添加。确定了培养基成分和发酵的基本条件。通过Plackett-Burman实验设计法考察了培养基组成和培养条件中的8个因素对降解酶合成的影响，从中筛选出三个影响降解酶产量的关键因素：甘油浓度、发酵温度和乳糖添加量。其它因素的最适条件为：酵母粉15g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐0.08mol/L，接种量5％，装液量100mL/500mL三角瓶，初始pH8.0，乳糖添加时间发酵后4小时。利用响应面分析进一步考察三个重要因素对降解酶合成的影响，通过回归方程得到上述三个条件的最优值分别为：甘油20.8g/L，发酵温度23.4℃，乳糖添加量13.08mmol/L。因此，优化后的最佳培养基组成和培养条件为：酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L K2HPO4·3H2O、0.08mol/L，KH2PO4、0.02mol/L。适宜的培养条件为：培养基起始pH值8.0、装液量100mL、接种量5%、培养温度37℃，转速,180r/min，工程菌E.coliBL2l（DE3）/pET30a-mpd在此条件下最佳产酶时间为12h，经优化后该菌株产酶活力为7.02U/mL。对降解酶进行提纯，酶的比活力提高29倍。并对酶性质做了初步研究，得到酶的最佳反应温度30℃最佳pH值8.0，在偏碱性条件下保存，可以常温存放。金属离子Fe2+、Mn2+对酶有强烈的激活作用。用纯化后的酶降解毒死蜱和马拉硫磷，用气相色谱检测，毒死蜱有微量残留，马拉硫磷未检出，说明酶对两种有机磷农药具有很好的降解效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 有机磷农药应用和发展趋势
• 1.2 有机磷农药的危害
• 1.2.1 有机磷农药对环境的影响
• 1.2.2 有机磷农药对人类的影响：
• 1.3 有机磷农药的防治与监管
• 1.4 有机磷农药的降解
• 1.4.1 有机磷农药的物理降解
• 1.4.2 有机磷的化学降解
• 1.4.3 生物降解
• 1.5 本课题研究的目的意义及主要内容
• 1.5.1 本课题研究的目的意义
• 1.5.2 本课题研究的主要内容
• 第二章 有机磷农药降解酶发酵条件的优化
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂及来源
• 2.1.4 主要溶液及配置方法
• 2.1.5 主要试验仪器及型号
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 种子液的制备
• 2.2.2 菌种质粒稳定性试验
• 2.2.3 菌种生长曲线的绘制
• 2.2.4 菌种最佳培养基及培养条件的单因素试验
• 2.2.5 菌种发酵条件的优化
• 2.2.6 酶活力的测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 质粒稳定性试验结果
• 2.3.2 菌体生长曲线
• 2.3.3 培养基优化结果
• 2.3.4 发酵条件的优化结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 有机磷农药降解酶性质的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 培养基及培养条件
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 溶液的配置
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 酶活测定方法
• 3.2.2 蛋白含量测定方法
• 3.2.3 粗酶液制备
• 3.2.4 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.5 凝胶层析
• 3.2.6 SDS-PAGE 电泳
• 3.2.7 酶性质研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蛋白标准曲线
• 3.3.2 酶的分离纯化
• 3.3.3 SDS-PAGE 电泳
• 3.3.4 酶性质研究
• 3.4 本章小结
• 第四章 结论
• 4.1 全文总结
• 4.2 本文创新与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文