论文摘要
肌萎缩侧索硬化（ALS）是中枢神经系统常见的一种慢性神经退行性疾病,以脑和脊髓中选择性的运动神经元变性为特征,临床表现为缓慢起病,进行性发展。ALS是一种致死性疾病,患者多在首次出现症状后的35年内死亡。目前,该病病因不清、发病机制不明、缺乏有效的治疗方法。目前证据提示ALS运动神经元的丢失是由于一些复杂的相互作用的机制所致,包括氧化应激、兴奋性毒性作用、细胞骨架异常和蛋白聚集以及遗传因素等。诸多研究表明这些机制之间并不是相互排斥的,在最终导致ALS的运动神经元死亡的不同机制中氧化应激可能起中心作用。氧化应激是指活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）及其代谢产物产生过多引起的细胞损伤。神经系统氧耗量大,多不饱和脂肪酸含量丰富,抗氧化能力相对较弱。与其他器官相比,神经系统更易受到氧化损伤。中枢神经系统含有非血红素铁,并且在特定部位如黑质和基底节中铁含量非常丰富。诸多研究表明,铁与氧化应激关系密切。铁离子如果不能以适当方式与蛋白或其它配体结合,其可以通过Fenton反应催化形成具有代谢毒性的ROS,攻击生物大分子,从而引起神经元变性。大量临床研究发现,在多种神经退行性疾病中都存在氧化应激和异常铁积聚的现象,如包括帕金森病和阿尔茨海默病在内多种神经退行性疾病病人脑内呈现病理性、区域性铁沉积。据此我们推测,铁过载导致的氧化应激在ALS的发病中可能发挥重要作用。我们应用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸（THA）诱导的脊髓体外器官型培养谷氨酸兴奋性毒性模型,探讨铁在谷氨酸兴奋性毒性中的作用,以及绿茶多酚EGCG和莱菔硫烷（SF）对运动神经元的作用和机制。采用免疫组织化学方法观察运动神经元的数目和形态,用Western blot方法检测标本蛋白水平的变化,用多功能酶标仪检测乳酸脱氢酶、丙二醛和谷氨酸的变化。研究发现,在谷氨酸兴奋性毒性模型中,转铁蛋白受体和二价金属离子转运体蛋白表达升高,铁蛋白表达降低,组织内总铁含量增加,氧化应激水平升高,运动神经元数目减少,给予铁螯合剂去铁敏可以有效阻止THA导致的氧化应激,保护运动神经元。绿茶多酚EGCG作用机制复杂,我们研究表明,EGCG可以通过降低细胞间隙的谷氨酸来对抗THA引起的兴奋性毒性,减轻氧化应激,保护运动神经元。莱菔硫烷是一个非常有效的Ⅱ相酶诱导剂,在肿瘤研究中,诸多学者对其进行了深入地探讨。我们发现莱菔硫烷可以通过诱导Ⅱ相解毒酶有效对抗THA引起的运动神经元死亡。另外,我们对谷氨酸兴奋性毒性模型进行了深入地分析研究,为进一步应用此模型进行实验研究夯实了基础。通过上述一系列实验研究,我们阐明了铁在谷氨酸兴奋性毒性中的重要作用以及EGCG和莱菔硫烷通过不同的机制保护运动神经元。这对于研究肌萎缩侧索硬化的发病机制和筛选有效的治疗药物提供了坚实的理论依据。第一部分铁在谷氨酸兴奋性毒性中的重要作用目的:在脊髓体外器官型培养谷氨酸兴奋性毒性模型中,观察铁转运、储存蛋白和铁含量的变化,并且应用铁螯合剂去铁敏,观察其对运动神经元是否具有保护作用。方法:应用脊髓体外器官型培养模型,随即分成3组:对照组、THA组和DFO+THA组。应用Western blot方法检测铁转运和储存蛋白水平的变化,用原子吸收光谱法测量组织中铁含量的变化,用免疫组化方法检测运动神经元数目,用多功能酶标仪检测组织中丙二醛的变化以及培养液中谷氨酸和乳酸脱氢酶的变化。结果:100μmol/L THA处理3周后,TfR、DMT1-IRE和DMT1+IRE蛋白表达升高,而Ft-H蛋白表达下降,组织中总铁含量增加。给予铁螯合剂DFO可以有效阻止THA引起的兴奋性毒性,保护运动神经元。但是DFO对于培养液中的谷氨酸没有影响。结论:铁在谷氨酸兴奋性毒性中起到重要作用,螯合铁可以有效阻止谷氨酸兴奋性毒性引起的运动神经元损伤。第二部分绿茶多酚EGCG对运动神经元的保护机制探讨目的:探讨绿茶多酚EGCG对运动神经元的作用和机制,为寻找肌萎缩侧索硬化的治疗药物提供理论依据。方法:应用脊髓体外器官型培养模型,随机分成3组:对照组、THA组和EGCG+THA组。用免疫组化方法检测运动神经元数目,用Westernblot方法检测Ⅱ相酶蛋白水平的变化,用多功能酶标仪检测组织中丙二醛的变化以及培养液中谷氨酸和乳酸脱氢酶的变化。结果:100μmol/L THA干预后运动神经元数目较正常对照组明显减少（P<0.05）,而用5μmol/L EGCG预处理48小时,再给予5μmol/L EGCG+100μmol/L THA联合处理3周后运动神经元数目较THA组明显增加（P<0.05）。EGCG+THA组培养液中谷氨酸的含量较THA组明显降低,同时检测MDA水平也显著下降（P<0.05）。与Ⅱ相酶诱导剂SF保护运动神经元不同,EGCG+THA处理3周后Ⅱ相解毒酶NQO-1和HO-1表达较THA组下降。结论:EGCG通过降低细胞间隙的谷氨酸,可以阻止THA引起的兴奋性神经毒性,保护运动神经元。第三部分莱菔硫烷诱导Ⅱ相酶表达保护大鼠脊髓运动神经元目的:探讨Ⅱ相酶诱导剂莱菔硫烷（SF）对运动神经元的作用和机制。方法:应用SD乳鼠脊髓体外器官型培养模型,随机分成3组:对照组、THA组和SF+THA组。用免疫组化法检测运动神经元数目,用Western blot法检测Ⅱ相酶蛋白水平,用多功能酶标仪检测培养液中谷氨酸的变化。结果:THA干预后运动神经元数目较对照组明显减少（P<0.05）,而应用SF预处理48 h,再给予SF和THA联合处理3周后运动神经元数目较THA组明显增加（P<0.05）,同时Ⅱ相酶NQO-1和HO-1表达明显升高（P<0.05）。结论:SF通过诱导Ⅱ相酶NQO-1和HO-1的表达,可以有效预防THA引起的运动神经元损伤。第四部分谷氨酸兴奋性毒性模型的研究目的:探讨谷氨酸兴奋性毒性模型-THA诱导的脊髓器官型培养模型培养液各成分中谷氨酸的含量及模型培养前后培养液中谷氨酸的变化。方法:应用脊髓体外器官型培养模型,随机分成2组:对照组、THA组。用免疫组化法检测运动神经元数目,用多功能酶标仪检测培养基中谷氨酸的含量。结果:最小基础培养基（MEM）和马血清（HS）中均含有谷氨酸。经过4周培养后,THA组培养液中谷氨酸的含量明显高于对照组,运动神经元数目较对照组减少。结论:THA诱导的脊髓器官型培养模型作为谷氨酸兴奋性毒性模型,我们在应用它时一定要严格检测培养液中谷氨酸的含量,对于每一个处理因素都要考虑其对谷氨酸的影响。
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