论文摘要
昆虫是世界上种类最多的动物。在长期演化过程中,自然界的大部分昆虫形成了蜕皮与变态这种特殊而重要的发育特征。变态昆虫在整个生命周期中,通过数次幼虫蜕皮和蛹变态发育,其外部形态、内部器官和生活习性等方面发生一系列的变化,从而形成卵、幼虫、蛹和成虫儿个不同的发育阶段或虫态。昆虫蜕皮与变态发育过程是在蜕皮激素（Molting hormone,MH）和保幼激素（Juvenile hormone,JH）的协同调控下,大量基因按照一定的时间、空间和次序被诱导或抑制表达来实现的。研究变态发育的激素调控机制对于阐明昆虫的生长、发育乃至起源进化都具有重要意义。家蚕是一种重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫研究的模式生物。家蚕有着长期的研究历史,积累了良好的研究基础,并保存有大量有价值的突变体及繁育系。对家蚕变态发育和激素调控研究,不仅有助于阐明家蚕变态发育的分子调控机理,促进人们对昆虫变态发育的遗传基础的认识,还能为家蚕发育的人为调节和害虫的生物防治提供重要线索。借鉴果蝇和其它昆虫变态发育研究的成果,利用家蚕基因组精细图和基因芯片等多种资源,我们对参与家蚕变态发育调节的激素信号传递通路相关的基因进行了基因组鉴定和比较基因组学分析,在基因组水平上分析了变态发育期间的基因表达谱,探究了激素调节与变态发育期基因表达变化的关系。获得的主要研究结果如下:1.家蚕保幼激素合成代谢及信号传导相关基因利用昆虫JH合成代谢及信号传递通路相关基因在家蚕基因组中进行同源性检索,鉴定家蚕JH相关基因。基于序列的相似性及功能域的保守性,我们鉴定了43个家蚕JH相关基因,其中,Acat、HMGS、HMGR、MevK、MevPK、MevPPD和IPPI等7个基因参与JH合成上游途径MVA,催化乙酰辅酶A生成异戊烯醇焦磷酸（IPP）。FPPS1-2催化IPP生成法尼焦磷酸（FPP）。SDR、FAMeT1-4、JHAMT1-7和Cyp15a1等13个基因参与JH合成下游途径异戊二烯分支途径。AT、AS和AlstR等3个基因参与JH合成的神经肽调节。JHE1-3、JHEH1-6和JHDK1-3等12个基因与JH代谢相关,JHBP、Met、EcR、USP、FKBP39和Chd64等6个基因参与JH信号传导。我们利用SNP分子标记将大部分JH相关基因（除AlstR外）定位到不同的染色体上,基因结构分析表明,FPPS、JHAMT、JHE、JHDK和JHEH等5个基因的不同拷贝分别呈现为成簇分布,这可为基因功能研究提供重要信息。比较基因组学分析发现,在家蚕、果蝇、按蚊、蜜蜂和赤拟谷盗等昆虫中,参与MVA途径的基因在5种昆虫中都是单拷贝,表明JH合成上游途径非常保守。FPPS基因在昆虫进化过程中形成不同的类型,推测这种分化直接导致了不同昆虫中JH种类的不同。参与JH合成异戊二烯分支途径及JH分解代谢的基因分化较大,这可能与不同昆虫合成不同JH种类相关。5种昆虫中参与JH信号传导的基因都是单拷贝,表明JH在不同昆虫中的信号传导机制是高度保守的。利用家蚕组织表达谱芯片数据,我们分析了家蚕JH相关基因在5龄3天各组织的表达特征。结果表明,大部分JH合成相关基因的表达量较低,JH代谢相关基因的表达水平却相对较高,而且不同组织中的表达基因类型也有差异。表达特征数据显示家蚕JH的合成在5龄3天受到抑制,而其代谢过程则被诱导,这可能导致了JH滴度在家蚕5龄3天开始降低。2.家蚕核受体基因家族核受体基因家族的许多成员是MH的受体,直接参与了MH对昆虫蜕皮与变态发育的级联调控。基于已知昆虫核受体基因信息和核受体保守结构域序列,采用同源性分析策略,我们在家蚕基因组中鉴定了19个核受体基因,其中14个成员具有典型的DNA结合功能域（DBD）和配体结合结构域（LBD）,15个成员定位在不同的染色体上。多序列比对发现,LBD的序列相似性明显低于DBD。比较基因组学分析发现,家蚕18个核受体基因与果蝇、按蚊、蜜蜂和赤拟谷盗的基因呈明显的直系同源关系,但在五种昆虫间并未发现共线性遗传现象存在。基于核受体基因保守结构域的遗传进化分析发现,不同昆虫中同一个核受体基因的直系同源体总是先聚成一类,这表明核受体基因在昆虫分化之前已经发生了分化。另一方面,家蚕核受体基因的LBD平均包含2.3个内含子,比其它四种昆虫中的高,这些关键功能域结构的变化,暗示核受体基因在功能上可能存在物种差异。我们应用RT-PCR技术和组织表达谱的芯片数据分析了家蚕核受体基因时空表达特征,结果发现,部分核受体基因在变态期的表达具有时期特异性。其中,核受体基因BmβFTZ-F1在上簇吐丝结茧前和化蛹前上调表达,这与MH滴度在变态发育期的变化趋势一致。与MH滴度变化相关联的还有BmEcR、BmUSP和BmHR3,并且这3个基因和BmβFTZ-F1的表达呈现级联机制。此外,对芯片数据分析发现,19个核受体基因中,只有BmEcR、BmE75、BmHR38、BmHR78和BmDSF等能检测到表达信号,其中BmE75、BmHR38和BmHR78在生殖腺、头和体壁中表达,BmEcR在中肠、体壁、脂肪体中表达,BmDSF在中肠、体壁、脂肪体和卵巢中高表达,这种表达特征与生理功能的关系有待于进一步深入研究。3.家蚕变态发育期基因表达谱的全基因组芯片分析应用家蚕全基因组芯片,我们分析了家蚕5龄幼虫-蛹-成虫变态期19个时间点的基因表达变化特征。分别采用信号值大于800和ratio值＞2倍的标准来分别确定基因是否表达和表达是否具有差异,并进一步利用等级聚类分析鉴定阶段特异表达基因。结果发现,在22987个探针中,共筛选到12097个探针具有表达信号,7628个探针所代表基因的表达具有时期差异。我们首先分析了激素相关基因在变态发育期的表达变化。在43个家蚕JH合成代谢及信号传递相关基因中,共检测到31个基因在家蚕变态发育期表达,其中参与MVA途径的酶类基因大部分在蛹-成虫的转变过程中表达,而BmFPPS的表达具有时期和性别特异性,即只在蛹发育后期和成虫期的雌性个体中表达,参与JH合成下游途径中的大部分基因也在蛹发育后期表达。由此推测,JH在家蚕雌蛹发育的后期和成虫期可能有适量合成,推测其可能与蛹后期卵的发生相关。核受体和MH合成相关基因的表达谱分析显示,在19个家蚕核受体基因中,11个核受体基因检测到表达信号,其中BmEcR和BmUSP基因在5龄7天表达,由此推测其可能与上簇期间的吐丝结茧生理相关。BmHR3在上簇36小时表达,BmβFTZ-F1在上簇48小时表达,由此推测,BmβFTZ-F1可能与蛹变态的启动相关,但其转录则受剑了BmHR3的调控。与MH合成相关的酶类基因BmCYP302a1、BmCYP315A1在上簇36小时（吐丝完毕前）开始上调表达,并持续到成虫期,BmCYP314A1在上簇120小时（化蛹后3天）开始上调表达,这与家蚕MH在蛹发育后期出现滴度峰相吻合。其次,我们比较了变态发育期基因表达的雌雄差异和阶段差异,结果发现,577个基因在雄性个体中高量表达,其中α-微管蛋白、β-微管蛋白、精巢特异蛋白tektin、精子发生分裂相关蛋白和苹果酸脱氢酶等与精巢发育或精子形成相关。352个基因在雌性个体中高量表达,其中卵壳蛋白基因群、卵黄蛋白和卵黄蛋白受体基因等主要在雌蛹发育后期表达,参与了这个时期卵的发生。特别重要的是,617个基因在吐丝结茧前高量表达,476和99个基因分别在吐丝完毕后和吐丝结茧/预蛹期高量表达。吐丝结茧前高表达的基因中,JH酯酶和JH环氧化物水解酶基因与JH降解相关,芳香基贮存蛋白、芳香基贮存蛋白β亚基、低分子量30kDa蛋白前体、30kDa蛋白19G1和21G1等和幼虫末期营养物质的贮存相关。吐丝完毕后大量表达的基因中,大部分具有酶催化和结构分子活性,推测其参与了该时期的组织溶解和组织发生等生理过程。有趣的是,我们在吐丝完毕后高表达的部分表皮蛋白基因的2000bp的UTR区域中,发现了同在此时上调表达的核受体βFTZ-F1的识别基序,表明βFTZ-F1在家蚕化蛹变态中对表皮蛋白基因的表达具有调控作用。吐丝结茧/预蛹期的主要生理过程是吐丝,在此期间上调表达的基因中,yellow蛋白可能与色素形成相关,serpin K、serpin-5B和antitrypsin等丝氨酸蛋白酶类抑制剂可能与保护丝蛋白在吐丝期不被蛋白酶降解相关。4.家蚕βFTZ-F1和Met基因的功能初探βFTZ-F1和Met分别作为MH受体和JH潜在受体,直接介导了激素在家蚕发育过程中的调控过程。我们在变态发育期对βFTZ-F1进行了RNAi实验,结果发现,βFTZ-F1的RNAi影响了家蚕幼虫-蛹的正常转变。RT-PCR分析发现,部分吐丝完毕后上调表达的表皮蛋白基因在βFTZ-F1的RNAi突变个体中的表达水平下调,初步推测突变型个体的产生可能与表皮蛋白基因的表达被抑制直接相关。同时,我们对家蚕JH潜在受体基因Met进行了全长cDNA克隆,序列分析表明Met基因在不同物种中的进化比较保守。表达谱分析表明BmMet基因在家蚕整个生命周期和5龄3天各组织中都有表达。而且表达水平相似,推测BmMet在JH信号传递通路中可能只是一个辅助因子,或者只是JH受体复合物中一个成员。5.家蚕变态发育的激素调节综合分析上述研究结果,初步发现家蚕JH种类的多样性与JH合成相关基因的拷贝数相关,JH代谢相关基因在5龄幼虫末期的高量表达导致了JH滴度的降低,而JH合成相关基因在雌蛹后期和成虫期表达,暗示JH在此阶段有合成,可能和雌蛹发育后期卵的发生相关。JH潜在受体基因Met的遍在表达,推测其可能只是JH信号传导的辅助因子之一。MH合成相关酶类基因在上簇36小时（吐丝完毕前）开始持续表达,导致了MH滴度在化蛹前和化蛹后的上升。核受体基因BmEcR-B、BmUSP-2、BmHR3和BmβFTZ-F1的表达谱表明其应该受到了MH的诱导,并且呈现级联调控现象。表皮蛋白基因UTR区BmβFTZ-F1识别基序的发现及BmβFTZ-F1干涉后表达水平的降低表明,表皮蛋白基因直接参与了化蛹变态,其转录可能受到BmβFTZ-F1的调节。其它时期特异基因的表达是否受到JH或MH的调控,则是我们下一步的研究目标。