成体小鼠胰腺干/祖细胞的活体追踪和离体鉴定研究

论文摘要

糖尿病是一类严重的代谢疾病,正危害着世界上越来越多人口的健康。胰岛移植是一种治疗糖尿病的有效方法,但因供体缺乏和移植后免疫排斥问题制约了其广泛应用。干细胞为具有强增殖能力和多向分化潜能的细胞,是利用细胞替代疗法治疗重大疾病的细胞来源,其中成体干细胞因不存在胚胎干细胞的致瘤性及伦理道德问题而被人们寄予厚望。但目前国际上对成体胰腺干细胞的研究进展缓慢,其主要障碍在于缺少公认的特异性标记物和可靠的检测系统,而无法准确指认胰腺干细胞。因此,目前的主要任务是准确定位、指认成体胰腺干细胞。本研究通过对新生1d小鼠皮下注射和E13.5d孕鼠腹腔注射Brdu不同剂量,摸索BrdU高效率标记小鼠胰腺细胞的最佳方法;然后对E13.5d孕鼠腹腔注射5针Brdu处理的小鼠进行长期追踪,确定LRCs在胰腺中的活体定位;通过STZ处理追踪小鼠诱导的糖尿病模型,研究小鼠胰腺活体损伤后LRCs增殖和分化能力,尤其是向β细胞分化的能力;通过G418处理、彻底消化所得胰腺单细胞分阶段接种及分阶段消化所得胰腺单细胞分阶段接种三种离体培养方法,研究LRCs的自我更新能力。结果表明:对E13.5d孕鼠腹腔注射5针Brdu、标记胎鼠胰腺细胞的方法是相对最好的;通过这种方法标记小鼠胰腺细胞后,经过10周追踪,这些LRCs在胰腺活体中大多数位于胰岛区,在腺泡中间也有少量分布,导管中极少见;小鼠胰腺中LRCs在受到STZ诱导的胰腺损伤刺激7天后能够发生增殖,10天后能够向胰岛素分泌细胞分化;在离体培养方法中,用50μg/mL G418处理48h,能达到去除成纤维细胞、纯化上皮细胞效果,但是得到的胰腺上皮细胞很难形成单细胞集落;彻底消化所得胰腺单细胞分阶段接种法,达到了去除成纤维细胞,富集胰腺上皮细胞目的,但是没有达到筛选出具有强增殖能力、能形成大的单细胞集落的成体胰腺干/祖细胞的目的;分阶段消化所得胰腺单细胞分阶段接种法中,通过将成体小鼠胰腺组织进行头20min消化,然后将所收集到的胰腺单细胞悬液分别进行头40min、过夜及再过夜三阶段接种、2%血清培养基继续培养这种方法,从过夜及再过夜接种培养的胰腺上皮细胞中筛选出了一群具有强增殖能力、能形成大的单细胞集落的细胞,经检测,这些具有集落形成能力的细胞来源于LRCs。活体和离体实验结果表明:成体小鼠胰腺LRCs中确实存在一群成体胰腺干/祖细胞。这为今后进一步研究胰腺干细胞增殖与定向分化调控机制以及它们特异性标志分子等问题奠定基础,也为今后成体干细胞真正应用于人类临床上糖尿病等胰腺相关疾病的治疗准备了条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 胰腺
• 1.1.1 胰腺的结构
• 1.1.2 胰腺的发育
• 1.2 成体胰腺干细胞及其对胰腺疾病和损伤的作用胰腺
• 1.2.1 糖尿病
• 1.2.2 成体胰腺干细胞
• 1.2.3 成体胰腺干细胞治疗糖尿病
• 1.2.4 成体胰腺干细胞与其它胰腺疾病和损伤的作用内分泌部
• 1.3 成体胰腺干细胞的鉴定方法
• 1.3.1 追踪Label-Retaining Cells（LRCs）法
• 1.3.2 活体胰腺损伤法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 主要试验器械的清洗和消毒
• 2.2.2 主要溶液的配制及试剂分装
• 2.2.3 小鼠BrdU标记、代谢追踪以及LRCs在胰腺中的活体定位
• 2.2.4 糖尿病模型建立及建模后胰腺中LRCs增殖、分化能力研究
• 2.2.5 胰腺中干/祖细胞的离体分离培养、鉴定研究
• 3 实验结果
• 3.1 小鼠BrdU标记、代谢追踪以及LRCs在胰腺中的活体定位
• 3.1.1 小鼠最佳BrdU标记条件摸索结果
• 3.1.2 标记小鼠BrdU代谢最佳时期追踪及LRCs在胰腺中活体定位
• 3.2 糖尿病模型建立及建模后胰腺中LRCs增殖、分化结果
• 3.2.1 糖尿病模型建立
• 3.2.2 糖尿病模型鼠胰腺中LRCs增殖、分化能力研究结果
• 3.3 胰腺中干/祖细胞的离体分离培养、鉴定结果
• 3.3.1 胰腺中干/祖细胞的离体分离培养结果
• 3.3.2 离体培养的胰腺中干/祖细胞鉴定结果
• 4 讨论
• 4.1 分阶段培养方法
• 4.2 成体胰腺干/祖细胞的定位
• 4.3 头20min消化并分三阶段纯化、筛选出的细胞的性质
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢