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草莓转基因体系的建立及脱落酸受体PYR1基因的功能分析

2020-12-11阅读(273)

草莓转基因体系的建立及脱落酸受体PYR1基因的功能分析

论文摘要

脱落酸（abscisic acid,ABA）作为一种植物激素,已证实不仅在调控植物休眠、衰老和抗逆境胁迫等过程中起着重要的作用,而且是调控果实发育的重要因子。近年来,尽管在模式植物拟南芥中关于ABA的信号识别及其信号转导的分子机制取得了突破性的进展,然而关于ABA调控果实发育的分子机制目前还不清楚。本研究以草莓为试材,在建立草莓稳定遗传转化体系和草莓果实中病毒诱导基因沉默体系的基础上,通过分析脱落酸受体PYR1基因在果实成熟中的作用,以期揭示ABA调控果实发育的信号识别机制。主要研究结果如下:（1）首先克隆了草莓中PYR1基因。该基因全长627bp,编码208个氨基酸,命名为FaPYR1基因,基因登录号为:JF268669.1。将克隆到的FaPYR1基因全长核苷酸序列反向插入到pCAMBIA1304质粒的BglⅡ和SpeⅠ酶切位点之间,构建成植物反义表达载体pCAMBIA1304-FaPYR1;选择FaPYR1中的424bp的序列插入到TRV2病毒载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间,构建成病毒介导的基因沉默载体pTRV2-FaPYR1。（2）以农杆菌为介导,将携带有FaPYR1基因的病毒载体对花后两周大绿果进行注射,一周后观察试验结果。研究发现,FaPYR1基因沉默抑制了草莓果实的成熟,即草莓果实沉默部位保持白色,不能着色,而同一果实的其它未侵染的部位则变成红色。对照草莓果实变红并软化。用半定量RT-PCR,荧光定量RT-PCR,western blot检验,均发现FaPYR1基因的表达被调低。荧光定量RT-PCR检测其下游信号基因表达量都不同程度的被调低。以上实验结果均表明,FaPYR1基因在草莓果实发育过程中起到重要的作用。本研究还发现,草莓果柄注射是建立病毒诱导基因沉默的有效方法。（3）以’红颜’草莓的叶片为外植体,以FaPYR1基因为报告基因,通过研究影响遗传转化的因素,建立了农杆菌介导的’红颜’草莓遗传转化体系:菌液浓度为OD600=0.4;侵染时间为8min;200mg/L的Cb作为抑菌抗生素,20mg/L的Kan作为筛选抗生素;共培养时间2天;共培养培养基:MS+TDZ（2.0mg/L）+ IBA（0.2mg/L）;筛选培养基:MS+TDZ（2.0mg/L）+IBA（0.2mg/L）+Kan（20mg/L）+ Cb（200mg/L）;伸长培养基:MS +6-BA（0.5mg/L）+NAA（0.1mg/L）+ Kan（20mg/L）+Cb（200mg/L）。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 引言
  • 1.1 草莓转基因研究进展
  • 1.1.1 草莓遗传转化体系的建立
  • 1.1.2 影响草莓遗传转化的主要因素
  • 1.1.3 草莓转基因目前存在的问题
  • 1.2 病毒诱导基因沉默体系
  • 1.2.1 病毒诱导基因沉默研究进展
  • 1.2.2 VIGS的机理
  • 1.2.3 烟草脆裂病毒载体TRV
  • 1.2.4 VIGS的优缺点
  • 1.3 脱落酸受体PYR1基因的研究进展
  • 第二章 草莓脱落酸受体PYR1基因克隆及植物表达载体的构建
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与试剂
  • 2.2.1 实验材料
  • 2.2.2 菌株与质粒
  • 2.2.3 酶及试剂
  • 2.2.4 实验仪器
  • 2.2.5 化学试剂及实验溶液配制
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 FaPYR1基因克隆
  • 2.3.2 FaPYR1基因反义植物表达载体的构建
  • 2.3.3 病毒介导的基因沉默载体的构建
  • 2.3.4 农杆菌转化
  • 2.4 结果与分析
  • 2.4.1 草莓叶片总RNA提取
  • 2.4.2 草莓中PYR1基因克隆与序列分析
  • 2.4.3 pCAMBIA1304-FaPYR1反义植物表达载体的构建
  • 2.4.4 病毒载体pTRV2-FaPYR1构建
  • 第三章 根癌农杆菌介导的草莓遗传转化体系的研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与试剂
  • 3.2.1 植物材料
  • 3.2.2 供试菌株
  • 3.2.3 培养基以及培养条件
  • 3.2.4 GUS检测液配制
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 外植体的选择
  • 3.3.2 卡那霉素筛选浓度的确定
  • 3.3.3 抑菌抗生素浓度的选择
  • 3.3.4 菌液的制备
  • 3.3.5 菌液浓度、侵染时间、共培养时间的优化选择
  • 3.3.6 GUS瞬间表达鉴定
  • 3.3.7 草莓的遗传转化步骤
  • 3.4 结果与分析
  • 3.4.1 卡那霉素浓度对草莓转化的影响
  • 3.4.2 抗生素浓度对草莓转化的影响
  • 3.4.3 菌液浓度、侵染时间、共培养时间的选择
  • 3.5 讨论
  • 第四章 FaPYR1基因在草莓果实成熟中的作用
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与试剂
  • 4.2.1 植物材料
  • 4.2.2 菌株与质粒
  • 4.2.3 酶及试剂
  • 4.2.4 实验仪器
  • 4.2.5 化学试剂及实验溶液配制
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 草莓果实七个时期及不同组织RNA的提取
  • 4.3.2 草莓叶片中基因组DNA的提取
  • 4.3.3 Southern杂交方法
  • 4.3.4 常用蛋白实验方法（参考蛋白手册）
  • 4.3.5 病毒诱导基因沉默在草莓果实中的应用
  • 4.3.6 草莓果实PYR1基因沉默分析
  • 4.4 实验结果
  • 4.4.1 草莓果实七个时期及不同组织RNA的提取
  • 4.4.2 FaPYR1基因在草莓中的拷贝数的分析
  • 4.4.3 草莓各个组织FaPYR1基因表达量分析
  • 4.4.4 草莓果实7个时期FaPYR1基因表达量分析
  • 4.4.5 侵染方法的建立
  • 4.4.6 病毒诱导草莓果实FaPYR1基因沉默表型分析
  • 4.4.7 病毒的分子检测
  • 4.4.8 RNA干扰后FaPYR1基因荧光定量RT-PCR
  • 4.4.9 RNA干扰后FaPYR1基因半定量RT-PCR
  • 4.4.10 RNA干扰后FaPYR1基因蛋白水平检测
  • 4.4.11 RNA干扰后FaPYR1基因下游信号基因表达量分析
  • 4.5 讨论
  • 第五章 全文总论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历
  • 硕士期间发表学术论文

    • 相关论文文献

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