基于微流控的蛋白质和核酸的多相印迹分析研究

论文摘要

印迹分析技术是生物学的许多分支中的支柱技术，应用非常广泛，但这经过这么多年的发展之后，一些固有的问题依然没有解决。尤其是随着细胞生物学，分子生物学，蛋白组学的发展，越来越迫切地需要在有限的样品中获得有关更多有关细胞信号通路以及蛋白质相互作用的信息，这对传统的印迹分析技术是很大的挑战，因为传统的印迹分析技术的分析通量非常有限，而且操作繁琐，不能满足现代生物医学诊断分析的需求。微流控技术是近二十年来发展起来的一项新型分析技术，利用微小的管道和腔室对流体以及被分析物进行处理，具有通量高，成本低，操作简便等优点，这些优点刚好能够克服传统印迹分析技术的缺点，所以我们试图将微流控技术整合到印迹分析技术中来，以期解决传统印迹分析技术中存在的问题。具体的，我们做了以下几个方面的尝试：使用软刻蚀技术制备微流控芯片，并且调节一下参数使得芯片适用于不同的印迹操作条件；使用粘性芯片，维克罗以及夹具这三种不同的方法，试图增强聚二甲基硅氧烷和聚偏氟乙烯这对非常规使用组合之间的粘合性能；将制备好的微流控芯片用于改进传统的印迹分析过程，包括在多种样品中进行多种参数的同时鉴定；在样品中引入分子量标尺；在一次实验中完成抗原以及抗体滴定；探索了微流控体系中孵育时间对结果的影响，以及利用管道鉴定相邻条带的功能；对于微流体系与开放体系的差异，提出了一些理论上的初步解释；将该分析体系应用于核酸，得到了类似的分析结果，证明了该体系的广泛适用性。通过这一系列的研究，我建立了一个简便的印迹分析系统，发现了一些独特的性质。此外，该系统中使用到的元件和方法都十分简单，易于推广，有望在不久的将来实现商业化，走进千百间生物学实验室，推动生物学的研究前行。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 概论
• 1.1 生物医学诊断
• 1.1.1 背景及概念
• 1.1.2 用于生物医学诊断的工具
• 1.2 小尺度工具
• 1.2.1 微流控
• 1.2.2 静电纺丝纳米纤维
• 1.2.3 硅纳米线
• 1.2.4 半导体量子点
• 1.2.5 金纳米颗粒
• 1.3 微流控技术
• 1.3.1 芯片上的实验室
• 1.3.2 微流控芯片技术的兴起
• 1.3.3 微流控芯片的制作材料
• 1.3.4 微流控芯片的制作过程
• 1.3.5 微流控中流体的基本特征
• 1.3.6 微流控技术的应用
• 1.4 印迹分析技术
• 1.4.1 印迹分析技术简介
• 1.4.2 印迹分析技术的步骤
• 1.4.3 印迹分析技术的探索
• 1.5 微流控技术和印迹分析技术的结合
• 1.6 本文研究的目的和主要内容
• 1.6.1 本文研究的必要性
• 1.6.2 本文研究的目的
• 1.6.3 本文研究的主要内容
• 1.6.4 本文研究的科学意义
• 2 蛋白负载基底的制备
• 2.1 引言
• 2.2 实验准备
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 购买的试剂及用品
• 2.2.3 配制的试剂
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 蛋白质样品制备
• 2.3.2 SDS-PAGE 分离蛋白质
• 2.3.3 电场驱动的蛋白质转移
• 2.3.4 转移后处理
• 2.4 实验结果及讨论
• 2.4.1 电泳对实验结果的影响
• 2.4.2 转膜对实验结果的影响
• 2.5 本章小结
• 3 微流控芯片的设计与制作
• 3.1 引言
• 3.2 实验准备
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 购买的试剂及用品
• 3.2.3 配制的试剂
• 3.3 实验步骤
• 3.3.1 紫外光刻制备硅片模板
• 3.3.2 制备后处理
• 3.3.3 软刻蚀制备 PDMS 弹性芯片
• 3.3.4 制备后处理
• 3.4 实验结果及讨论
• 3.4.1 管道的高宽比
• 3.4.2 管道排列的疏密程度
• 3.4.3 管道入口的排列
• 3.4.4 管道入口槽的设计
• 3.4.5 硅烷化
• 3.5 本章小结
• 4 微流控芯片与蛋白基底的组装
• 4.1 引言
• 4.2 实验准备
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 购买的试剂及用品
• 4.2.3 配制的试剂
• 4.3 实验步骤
• 4.3.1 常规组装
• 4.3.2 基于粘性芯片的组装
• 4.3.3 基于维克罗的组装
• 4.3.4 基于夹具的组装
• 4.4 实验结果及讨论
• 4.4.1 常规组装
• 4.4.2 基于粘性芯片的组装
• 4.4.3 基于维克罗结构的组装
• 4.4.4 基于夹具的组装
• 4.5 本章小结
• 5 基于微流控的蛋白质多相检测
• 5.1 引言
• 5.2 实验准备
• 5.2.1 仪器
• 5.2.2 购买的试剂及用品
• 5.2.3 配制的试剂
• 5.3 实验步骤
• 5.3.1 多样品多参数同时检测
• 5.3.2 抗原抗体滴定
• 5.3.3 抗体孵育时间的比较
• 5.3.4 相邻蛋白样品的判定
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 多样品多参数同时检测
• 5.4.2 抗原抗体滴定
• 5.4.3 抗体孵育时间的比较
• 5.4.4 相邻蛋白样品的判定
• 5.4.5 跳过封闭步骤的检测
• 5.4.6 为什么微流控体系需要更高的初始抗体浓度
• 5.5 本章小结
• 6 基于微流控的核酸多相分析
• 6.1 引言
• 6.2 实验准备
• 6.2.1 仪器
• 6.2.2 购买的试剂及用品
• 6.2.3 配制的试剂
• 6.3 实验步骤
• 6.3.1 PAGE 分离寡链核苷酸样品
• 6.3.2 电场驱动的转移
• 6.3.3 核酸的杂交检测
• 6.4 实验结果及讨论
• 6.5 本章小结
• 7 总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录