转基因克隆兔的相关研究

论文摘要

供体细胞在体外培养的时间和培养代数对体细胞核移植效率有重要影响。本研究通过对5-10低代数组和20-25高代数组的兔成纤维细胞进行核移植研究,结果发现两个实验组供体细胞之间的核移植的效率存有差异。通过对供体细胞进行核移植后的重构胚胎的融合率、卵裂率、囊胚率以及体内发育的比较,发现低代数相对来说效率较高,但是高代数组也能获得正常的克隆后代。本研究验证了兔不同代数体外培养细胞对克隆效率的影响,为制备基因打靶兔提供了理论依据和时间窗口。体细胞核移植已经成为制备转基因动物的常用技术,体细胞的转染效率已经成为制约转基因效率的重要因素。本实验通过脂质体转染体外培养的成纤维细胞,转染后按1：40和1：80两个密度进行稀释,生长至30%-40%汇合度时加入G418进行筛选,最终共获得细胞克隆41个,其中绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞克隆12个,两种稀释密度均可获得单细胞长满形成的GFP克隆,但低密度的效率更高,1：80可作为细胞筛选的适合密度。实验获得的结果为提高细胞转染效率和转基因动物制作的成功率提供了参考。胚胎冷冻保存已经成为动物保种,实验动物胚胎运输的一个必不可少的有效工具。玻璃化冷冻是一种快速冷冻方法,不需要特殊的设备。本研究将筛选出带有绿色荧光的胚胎应用玻璃化方法进行冷冻并将非绿色荧光的胚胎筛选出来后也进行玻璃化冷冻。将冷冻复苏后形态完整的胚胎进行体外培养,有47%的非GFP胚胎发育至囊胚。将复苏的GFP转基因桑椹胚移植到受体代孕母兔体内,21%的胚胎发育为胎儿。最终,通过玻璃化冷冻获得了4个转基因后代仔兔,并已经成活四个月以上。结果表明,GFP胚胎可以成功的应用玻璃化冷冻保存,并且应用荧光显微镜进行筛选能显著提高转基因胚胎保存的效率。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 体细胞核移植技术的发展趋势
• 1.2 影响体细胞核移植的效率的因素
• 1.3 兔供体细胞代数对克隆效率的影响的研究
• 1.4 转基因动物的前景
• 1.5 转基因效率的影响因素
• 1.6 为转基因克隆兔建立一个合适的供体细胞筛选体系
• 1.7 传统的冷冻方法
• 1.8 胚胎冷冻的研究进展
• 1.9 玻璃化冷冻的出现
• 1.10 玻璃化冷冻的进展
• 1.11 玻璃化冷冻在兔胚胎冻存中的应用
• 2 体细胞核移植的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 试剂
• 2.1.1.2 实验动物
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 供体细胞准备
• 2.1.2.2 MⅡ期卵母细胞准备
• 2.1.2.3 核移植操作和重构胚的激活
• 2.1.2.4 克隆胚胎的体外培养和观察
• 2.1.2.5 胚胎移植、剖腹产及护理
• 2.1.2.6 数据处理
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 细胞的培养
• 2.2.2 不同代数供体细胞克隆胚胎的体外发育
• 2.2.3 不同代数供体细胞克隆胚胎的体内发育
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 兔成纤维细胞基因转染的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 细胞培养试剂
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 试验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒的提取
• 3.2.2 DMEM/F12同化培养基的制备
• 3.2.3 基因转染用细胞的准备
• 3.2.4 原代细胞计数
• 3.2.5 选择合适密度的细胞转染
• 3.2.6 基因转染后细胞换液和梯度稀释
• 3.2.7 转基因细胞系的PCR鉴定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 兔成纤维细胞基因转染后筛选的结果统计
• 3.3.2 转基因单克隆PCR鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 4 转基因胚胎玻璃化冻存的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验用试剂
• 4.1.2 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 供体的超排处理和胚胎的体外收集选择
• 4.2.2 玻璃化冷冻的程序
• 4.2.3 胚胎复苏
• 4.2.4 复苏胚胎移植
• 4.2.5 统计学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 复苏胚胎的体外发育
• 4.3.2 复苏胚胎的体内发育
• 4.3.3 PCR及琼脂糖凝胶电泳结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢