论文摘要
研究背景：随着心脏移植、冠状动脉搭桥以及经皮冠脉介入等治疗手段广泛地应用于临床,心肌缺血再灌注损伤已成为临床上常见的一种病理生理现象。细胞凋亡在心肌缺血后即触发并因再灌注而加重,减少缺血和再灌注过程中心肌细胞凋亡可以挽救更多的心肌,提高心肌缺血后再灌注治疗的效果。血红素氧合酶1（HO-1）,是血红素氧合酶的诱导型,研究表明HO-1被诱导适应性表达能发挥抗细胞凋亡的作用。多种因素可通过信号转导通路ERK1/2或PI3K/Akt激活并促使红细胞系核因子-2相关因子-2（Nrf2）向核内转位、并与细胞核内抗氧化反应元件（ARE）上相应位点相互作用,上调HO-1的表达与酶活力,减轻各种应激状态下组织细胞的损伤。羟基红花黄素A （HSYA）是药用植物红花的最主要的有效成分。研究发现,HSYA可以减轻组织细胞的缺血再灌注损伤,可以抑制低氧诱导的内皮细胞凋亡目前尚未见到有关HSYA对缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的影响及其机制的研究报道。本研究探讨HSYA对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响及其分子机制,分两部分进行。第一部分羟基红花黄素A上调血红素氧合酶-1的表达抑制缺氧／复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡目的：利用体外细胞缺氧/复氧（A/R）模拟体内组织细胞缺血再灌注诱导H9c2心肌细胞凋亡,给予HSYA干预,探讨其对A/R诱导的心肌细胞凋亡的影响和其分子机制。方法：H9c2心肌细胞随机分为对照组、A/R组、A/R并给予不同剂量（1、5、20、80μM） HSYA干预组,MTT法检测各组H9c2心肌细胞活力,酶联免疫分析法检测各组H9c2心肌细胞上清液肌钙蛋白Ⅰ浓度,蛋白免疫印迹技术测定各组H9c2心肌细胞HO-1蛋白表量。然后用随机分成的对照组、A/R组、A/R并给予HSYA20μM干预组、HO-1抑制剂（ZnPP-Ⅸ）组继续进一步的实验,测定各组H9c2心肌细胞的HO-1酶活力,FITC-Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组H9c2心肌细胞的凋亡率,蛋白免疫印迹技术测定各组H9c2心肌细胞HO-1蛋白表量、裂解的caspase-3 （CC3）表达量和细胞线粒体Bcl-2/Bax比值。结果：1.HSYA提高了经历A/R的H9c2心肌细胞的活力。2. HSYA减轻了经历A/R的H9c2心肌细胞的损伤。3. HSYA上调了经历A/R的H9c2心肌细胞的HO-1表达。4. ZnPP-Ⅸ对HSYA上调经历A/R的H9c2心肌细胞的HO-1表达的作用没有明显影响。5. HSYA上调经历A/R的H9c2心肌细胞HO-1的酶活力被ZnPP-Ⅸ抑制。6. HSYA抗A/R诱导H9c2心肌细胞凋亡的作用被ZnPP-Ⅸ部分消除。7. ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA上调经历A/R的H9c2心肌细胞线粒体Bcl-2/Bax比值的作用。8. ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA降低经历A/R的H9c2心肌细胞CC3表达量的作用。结论：HSYA通过上调HO-1的表达量和酶活力抑制A/R诱导的H9c2心心肌细胞凋亡从而减轻了细胞损伤。第二部分羟基红花黄素A上调经历缺氧/复氧的H9c2心肌细胞血红素氧合酶-1的表达的信号转导通路目的：紧接着第一部分的研究工作,利用体外A/R模拟体内缺血再灌注诱导H9c2心肌细胞凋亡,并给予HSYA干预,探讨HSYA在抗A/R诱导的心肌细胞凋亡作用中上调HO-1表达的细胞信号转导通路机制。方法：H9c2心肌细胞随机分为对照组、A/R组、HSYA 20μM干预组、HO-1抑制剂组,蛋白免疫印迹技术测定各组H9c2心肌细胞p-ERK1/2, p-Akt蛋白表量。然后用随机分成的对照组、A/R组、HSYA 20μM干预组、P13K抑制剂（LY294002）组继续进一步的实验,蛋白免疫印迹技术测定各组H9c2心肌细胞p-Akt、HO-1、CC3蛋白表量和各组H9c2心肌细胞核蛋白中Nrf2的量。结果：1. HSYA和ZnPP-IX对经历A/R的H9c2心肌细胞的ERK1/2的磷酸化没有明显影响。2. HSYA促进经历A/R的H9c2心肌细胞Akt磷酸化而ZnPP-Ⅸ对HSYA增强H9c2心肌细胞Akt磷酸化的作用没有明显影响。3. HSYA促进经历A/R的H9c2心肌细胞Akt磷酸化的作用被LY294002阻断。4.LY294002部分地阻断了HSYA上调经历A/R的H9c2心肌细胞HO-1表达的作用,并显著地削弱了HSYA降低经历A/R的H9c2心肌细胞CC3表达量的作用。5. HSYA促进经历A/R的H9c2心肌细胞Nrf2向核内转位的作用被LY294002部分阻断。结论：HSYA减轻细胞损伤可能机制之一是通过激活PI3K/Akt信号转导通路,促使核因子Nrf2转位于细胞核内,与抗氧化反应元件上相应位点相互作用,从而上调血红素氧合酶1的表达和活性。
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