论文摘要
NYD-SP12是前期克隆出的一条人睾丸特异性新基因。小鼠原位杂交实验表明其mRNA主要在精母细胞阶段表达,体外细胞转染实验发现NYD-SP12-GFP（green fluorescent protein）融合蛋白位于高尔基复合体上,在体睾丸基因转染显示NYD-SP12-GFP融合蛋白成顶体泡样位于精子细胞核的一侧,并最终出现在成熟精子的顶体。高尔基体在顶体的形成中发挥了关键的作用,它随着精子的成熟而不断产生形成顶体所需的蛋白质和膜类。前期的研究提示NYD-SP12与精子的顶体形成密切相关,所以本研究主要探讨了NYD-SP12在顶体形成中的明确作用及其机制。首先在蛋白水平研究了NYD-SP12在人精子中的表达和定位。原核表达重组NYD-SP12蛋白,纯化后免疫动物制备了特异性抗体。WesternBlot检测了NYD-SP12在人精子中的表达模式;免疫荧光结果显示NYD-SP12主要位于人精子的顶体。结合前期的研究结果,我们推测NYD-SP12参与了精子的顶体形成过程。进一步以生精细胞为模型,研究了NYD-SP12在顶体形成过程中的具体作用。由于NYD-SP12在小鼠中有高度同源基因,我们在小鼠精母细胞系中超表达小鼠NYD-SP12,然后分别用BODIPY TR染色和透射电镜技术来观察细胞内高尔基体和囊泡的变化情况。结果显示超表达NYD-SP12的小鼠精母细胞高尔基体膨胀,形成了许多囊泡,而且有很多囊泡聚集在核的一侧。超表达NYD-SP12被knockdown的小鼠精母细胞高尔基体没有膨大的现象,这进一步证实了上述高尔基体膨胀的现象是由NYD-SP12引起的。我们推测NYD-SP12通过促进高尔基体形成前顶体囊泡和囊泡的向核转运来参与调控精子顶体的形成。NYD-SP12含有一个TPR（tetratricopeptide repeat）-like结构域,该结构域能够介导蛋白质之间的相互作用和蛋白复合物的形成。将NYD-SP12-flag质粒转染小鼠精母细胞,用anti-flag抗体免疫共沉淀结合质谱分析鉴定了NYD-SP12的相互作用蛋白Lamin A,并用Western Blot进行了验证。NYD-SP12与Lamin A复合物以怎样的机制来到调控顶体形成还有待于进一步的深入研究。圆头精子症（Globozoospermia）是一种比较少见但是很严重的男性不育症,其典型特征为精子的头部呈圆形,没有顶体。最后,我们证实了NYD-SP12很可能参与到临床圆头精子症的病理发生。免疫荧光结果显示圆头精子头部缺失NYD-SP12,Western blot结果显示NYD-SP12在圆头精子中表达量显著下降。电镜分析表明这些圆头精子顶体形成有不同发育程度的异常,发现了残留的高尔基体膜和未融合的囊泡。这些结果表明NYD-SP12可能是导致人圆头精子症的候选基因。综上所述,NYD-SP12位于人精子的顶体,通过促进高尔基体形成囊泡和囊泡的向核转运来调控精子的顶体形成过程。在小鼠精母细胞系中NYD-SP12与Lamin A存在着相互作用。NYD-SP12很可能参与到圆头精子症的病理发生,对于临床男性不育的诊断和治疗具有重要指导意义。