产纤维素酶菌的诱变育种及产酶特性研究

论文摘要

在目前对于纤维素物质生物转化利用的研究中,主要涉及纤维素降解微生物资源的开发,纤维素酶活性的提高以及优化工艺参数等热点问题。因此,获得高效纤维素分解菌,优化纤维素酶的发酵条件,提高酒精产率,降低燃料酒精生产的成本,对于合理利用资源,降低环境污染具有极其重要的意义。本研究针对纤维素类物质生物利用的热点问题,以本实验室分离筛选的纤维素降解菌FLZ6和FLZ10为研究对象,分别从诱变选育高纤维素酶活性的降解菌、优化产酶条件、纤维素酶组分分析及酶学性质研究角度进行了研究和讨论。根据形态学和微生物细胞膜脂肪酸特异性分析,鉴定FLZ6为地衣形芽孢杆菌（Bacillus-licheniformis）,FLZ10为毛壳菌（Chaetomium spp）。经紫外诱变育种,获得155株FLZ6的突变株和137株FLZ10的突变株,其正突变率分别为18.7%和23.6%;以菌株在刚果红培养基上降解圈与菌落直径的比值（H/d）和纤维素酶活为指标,选育正突变株;经连续传代培养,获得遗传稳定性较好FLZ6的正突变株C6-4和FLZ10的正突变株M6。诱变株C6-4的CMC、FP酶活分别为18.6U和16.4U,比出发菌株FLZ6相比酶活分别提高21.5%和28.3%;突变株M6的CMC、FP酶活分别为62.6U和59.1U,比出发菌株FLZ10相比酶活分别提高24.7%和37.1%。为获得高酶活,对固体发酵产酶培养基成分和环境因子进行优化,得到最适产酶培养条件:对C6-4菌株,最佳混合碳源秸秆/麸皮添加比例为8:2,最佳氮源为,氮源的最佳添加量为3%,最佳接种量15%,最适产酶温度为40℃,最适pH6.0,最适发酵时间为3天,与原始菌株FLZ6相比,其FP酶活提高了49.1%;对M6菌株,最佳混合碳源秸秆/麸皮添加比例为7:3,最佳氮源为（NH4）2HPO4,（NH4）2HPO4的最佳添加量为3%,最佳接种量10%,最适产酶温度为40℃,最适pH5.5,最适发酵时间为3天,与原始菌株FLZ6相比,其FP酶活提高了54.5%。通过SDS-PAGE电泳对C6-4和M6进行特异性酶蛋白组分分析,得出以下结论:C6-4具有9种蛋白质,与原始菌株FLZ6相比,增加一条蛋白质条带,其增加的条带酶分子量为40.7KD,在63.4KD处酶蛋白含量有所减少,但在34.8KD和40.0KD处蛋白质含量有所增加;M6具有12种蛋白质,与原始菌株FLZ10相对,增加一条蛋白质条带,其增加的酶分子量为68.1KD,在92.0KD处酶蛋白含量有所减少,但在97.4KD处蛋白质含量有所增加;酶学性质分析表明,C6-4酶的最佳抽提时间60 min,最适温度50℃,CMC酶的最适pH值7.0,FP酶的最适pH值6.0;M6酶的最佳抽提时间为60 min,最适温度为50℃,CMC酶的最适pH值为5.0,FP酶的最适pH值为4.5。通过紫外诱变筛选得到了的优良突变菌株,其产酶量明显提高,因而既可以用于纤维素酶扩大生产研究,也可以用于纤维素菌酶发酵工艺,有很高的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 纤维素简介
• 1.1.1 纤维素的组成和结构
• 1.1.2 纤维素的降解
• 1.2 纤维素酶的研究进展
• 1.2.1 纤维素酶的来源
• 1.2.2 纤维素酶的组成
• 1.2.3 纤维素酶的理化性质
• 1.2.4 纤维素酶的降解机理
• 1.3 纤维素酶菌株的诱变育种
• 1.3.1 诱变的作用机理
• 1.3.2 剂量的选择
• 1.3.3 影响诱变效果的因素
• 1.3.4 高产突变菌株的筛选
• 1.3.5 纤维素酶菌种选育情况
• 1.3.6 发酵条件对产酶的影响
• 1.4 本课题研究的目的及研究内容
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 研究的目的及意义
• 1.4.3 主要研究内容
• 第2章 实验材料与实验设计
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 菌种来源
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法及分析方法
• 2.2.1 FLZ10、FLZ6 的出发菌株的筛选
• 2.2.2 FLZ10、FLZ6 的脂肪酸鉴定
• 2.2.3 诱变方法，筛选方法
• 2.2.4 固体、液体发酵产酶比较
• 2.2.5 粗酶提取
• 2.2.6 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.2.7 酶活测定
• 2.2.8 电子显微镜观察
• 2.3 实验设计
• 2.3.1 诱变菌株M6，C6-4 遗传稳定性实验
• 2.3.2 M6、C6-4 与初发菌株FLZ10、FLZ6 SDS-PAGE凝胶电泳分析
• 2.3.3 培养条件对产酶的影响
• 2.3.4 培养基成分对产酶的影响
• 2.3.5 抽提时间对酶活力的影响
• 2.3.6 酶学性质研究
• 第3章 纤维素酶菌株的鉴定及紫外诱变育种
• 3.1 FLZ10 和FLZ6 出发菌株的筛选
• 3.1.1 FLZ6 的筛选
• 3.1.2 FLZ10 的筛选
• 3.2 FLZ10 和FLZ6 的鉴定
• 3.2.1 FLZ10 和FLZ6 的培养特征
• 3.2.2 菌株的个体形态特征
• 3.2.3 菌株细胞膜短链脂肪酸特异性
• 3.3 FLZ10 和FLZ6 的紫外诱变育种
• 3.3.1 FLZ10 诱变株的筛选
• 3.3.2 FLZ6 诱变株的筛选
• 3.4 突变株M6 和C6-4 的遗传稳定性实验
• 3.5 本章小结
• 第4章 M6 和C6-4 固态发酵产酶条件确定
• 4.1 M6 和C6-4 固态、液态发酵产酶比较
• 4.2 诱变株M6 的固态发酵产酶条件优化
• 4.2.1 温度对产酶的影响
• 4.2.2 pH对产酶的影响
• 4.2.3 接种量对产酶的影响
• 4.2.4 发酵时间对产酶的影响
• 4.2.5 不同氮源对产酶的影响
• 4.2.6 氮源添加量对产酶的影响
• 4.2.7 秸秆麸皮比例对产酶的影响
• 4.3 诱变株C6-4 的固态发酵产酶条件优化
• 4.3.1 温度对产酶的影响
• 4.3.2 pH对产酶的影响
• 4.3.3 接种量对产酶的影响
• 4.3.4 发酵时间对产酶的影响
• 4.3.5 不同氮源对产酶的影响
• 4.3.6 氮源添加量对产酶的影响
• 4.3.7 秸秆麸皮比例对产酶的影响
• 4.4 本章小结
• 第5章 M6 和C6-4 的产酶特性研究
• 5.1 FLZ6、FLZ10、M6 和C6-4 的酶组分研究
• 5.1.1 FLZ6、FLZ10、M6 和C6-4 的蛋白质组分比对
• 5.1.2 FLZ6、FLZ10、M6 和C6-4 的蛋白质的分子量测定
• 5.2 M6 的酶学性质研究
• 5.2.1 抽提时间对酶活力的影响
• 5.2.2 酶促反应的最适温度
• 5.2.3 酶促反应的最适pH
• 5.3 C6-4 的酶学性质研究
• 5.3.1 抽提时间对酶活力的影响
• 5.3.2 酶促反应的最适温度
• 5.3.3 酶促反应的最适pH
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢