有机磷水解酶纳米凝胶生物材料的研制与应用

论文摘要

有机磷水解酶（OPH）是含有双金属阳离子活性中心的酰胺水解酶。由于它能够高效地催化有机磷类化合物水解,目前已经成为有机磷类杀虫剂和化学武器生物解毒材料的研究热点。经过20多年的发展,有机磷水解酶的合成、表征和理论研究已经逐渐走向成熟,但原始有机磷水解酶对环境变化敏感的特性使得它的实际应用依然停留在起步阶段。于是,研究者们开始致力于对这种酶进行修饰和稳定,以实现它们在日常生活和生产中的应用。本文采用表面丙烯酰化和自由基聚合对有机磷水解酶的表面进行单分子化学修饰,得到了同时具有表面官能性、环境稳定性以及高效催化性的核-壳结构有机磷水解酶纳米凝胶,实现了有机磷水解酶在细胞内的高效解毒。在此基础上,以有机磷水解酶纳米凝胶为结构单元,借助旋转涂膜、喷涂或者静电纺丝等常用加工手段,得到了能够循环水解有机磷化合物的生物催化薄膜和纤维复合材料。最后以牛血清蛋白为模型分子,通过纳米凝胶自组装制备了具有微-纳米多级孔结构的过滤膜。具体研究内容和主要结论如下:1.有机磷水解酶纳米凝胶的制备通过电击转染的方法成功地从大肠杆菌BL21菌株中诱导表达了OPH,利用体积排除色谱和离子交换色谱柱分离和提纯得到了米氏常数（Km）和催化活力分别为70 mM和22,320 U/mL的OPH样品。随后,通过表面丙烯酰化和溶液原位自由基聚合两步反应合成了OPH纳米凝胶。动态光散射和透射电镜测试结果证明:这种以蛋白分子为核、轻度交联聚合物为壳的纳米凝胶直径在15 nm左右,且尺度分布均匀。通过改变聚合单体种类和比例,得到了表面分别带正电和电中性的OPH纳米凝胶1和OPH纳米凝胶2,并借助Zeta电势和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其表面电荷进行了表征。2.有机磷水解酶纳米凝胶稳定性研究对比了原始OPH、OPH纳米凝胶1和OPH纳米凝胶2在不同温度、pH值、有机溶剂加入量以及生理环境下的催化活力。实验结果证明:在原始OPH完全失活的条件下,OPH纳米凝胶依然保持80%以上的催化活力,说明其具有优异的温度稳定性;与此同时,在接近中性溶液以及二甲基亚砜和甲醇存在下,OPH纳米凝胶催化活力远高于原始OPH,从而表现出优异的pH以及有机溶剂稳定性。对比不同pH环境下这三种生物催化剂的催化动力学参数发现:壳层聚合物表面化学修饰并不影响OPH活性中心与底物的亲和力（Km不变）,同时也不阻碍底物的扩散和产物的离去。此外,由于表面氨基具有质子化作用,OPH纳米凝胶1对环境改变有一定的缓冲能力,表现出较高的环境稳定性。3.有机磷水解酶细胞内解毒效果通过对OPH及其纳米凝胶进行荧光标记,系统地研究了原始OPH、OPH纳米凝胶1以及OPH纳米凝胶2分别在贴壁细胞系（Hela细胞、Hek293细胞）和悬浮细胞系（Jurkat细胞）中的细胞毒性和细胞摄入效率。实验结果证明,原始OPH及其纳米凝胶都表现出低细胞毒性。流式细胞术和荧光显微镜研究结果表明:原始OPH不能直接进入细胞;OPH纳米凝胶2能够被细胞摄入,但效率较低;OPH纳米凝胶1能够迅速大量地进入细胞,细胞摄入效率很高。分别采用EEA1抗体和Rab7抗体对Hela细胞的亚细胞器早期内涵体和初级溶酶体进行免疫荧光标记,跟踪了Hela细胞摄入OPH纳米凝胶1的过程,发现OPH纳米凝胶1首先吸附在Hela细胞的细胞膜上,随后逐渐穿过细胞膜进入细胞质中。具体而言,OPH纳米凝胶1通过细胞内吞作用存在于早期内涵体中,之后经过晚期内涵体进入到初级溶酶体内。4.有机磷水解酶纳米凝胶生物催化复合材料以OPH纳米凝胶作为结构单元,利用其表面不饱和双键与共聚单体反应,借助旋转涂膜或者喷涂装置,在多种基体材料（玻璃、硅片、云母、碳膜）上制备了均匀的OPH纳米凝胶薄膜。此外,利用OPH纳米凝胶表面原始蛋白分子所缺少的疏水基团,将OPH纳米凝胶成功地吸附到静电纺丝聚苯乙烯和聚丙烯腈纤维表面,得到了具有高催化活力的OPH纳米凝胶/聚合物纤维复合材料。荧光显微镜和扫描电镜结果表明,OPH纳米凝胶能够均匀地分散在薄膜内或者聚合物纤维表面,没有发生明显的聚集沉淀,因此保持了核心OPH的催化活力。5.模型蛋白纳米凝胶多孔膜的制备以牛血清蛋白（BSA）为OPH的模型蛋白合成了BSA纳米凝胶,飞行时间质谱和动态光散射证明BSA纳米凝胶属于单分子纳米凝胶。BSA纳米凝胶在溶剂挥发过程中自组装形成多孔膜,扫描电镜、原子力显微镜和荧光显微镜结果表明,蛋白纳米凝胶自组装膜具有微-纳米多级孔结构。变温红外结果证明,BSA纳米凝胶表面酰胺基团之间的氢键作用力是其自组装的驱动力。这种同时具备纳滤膜和生物酶优势的多孔膜,在有机磷农药废水处理中有很大的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 有机磷水解酶
• 1.1.1 有机磷类化合物
• 1.1.2 有机磷水解酶的来源
• 1.1.3 有机磷水解酶的结构与催化机理
• 1.2 有机磷水解酶的修饰与固定
• 1.2.1 有机磷水解酶的物理修饰与固定
• 1.2.2 有机磷水解酶的化学修饰与固定
• 1.3 本课题的主要研究内容和意义
• 参考文献
• 第二章 有机磷水解酶及其纳米凝胶的制备
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验原料，仪器及设备
• 2.2.2 有机磷水解酶在大肠杆菌中的表达
• 2.2.3 有机磷水解酶的提纯
• 2.2.4 有机磷水解酶纳米凝胶的制备
• 2.2.5 表征手段
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 有机磷水解酶的表达与提纯
• 2.3.2 有机磷水解酶纳米凝胶的制备
• 2.4 本章结论
• 参考文献
• 第三章 有机磷水解酶纳米凝胶的环境稳定性
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验原料，仪器及设备
• 3.2.2 有机磷水解酶及其纳米凝胶催化动力学参数的测定
• 3.2.3 有机磷水解酶纳米凝胶热稳定性研究
• 3.2.4 有机磷水解酶纳米凝胶的pH 稳定性研究
• 3.2.5 有机磷水解酶纳米凝胶的有机溶剂稳定性研究
• 3.2.6 表征手段
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 有机磷水解酶纳米凝胶温度稳定性
• 3.3.2 有机磷水解酶纳米凝胶的pH 稳定性
• 3.3.3 有机磷水解酶纳米凝胶的有机溶剂稳定性
• 3.4 本章结论
• 参考文献
• 第四章 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞内解毒效果
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验原料，仪器及设备
• 4.2.2 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞毒性
• 4.2.3 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞内吞效率
• 4.2.4 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞内吞过程
• 4.2.5 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞解毒能力
• 4.2.6 表征手段
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞毒性
• 4.3.2 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞内吞效率
• 4.3.3 有机磷水解酶纳米凝胶的细胞内吞过程
• 4.3.4 有机磷纳米凝胶的细胞解毒能力
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 有机磷水解酶纳米凝胶薄膜及纤维复合材料
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验原料，仪器及设备
• 5.2.2 有机磷水解酶纳米凝胶薄膜的制备
• 5.2.3 静电纺丝制备聚合物纤维
• 5.2.4 有机磷水解酶纳米凝胶/聚合物纤维复合材料的制备
• 5.2.5 表征手段
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 有机磷水解酶纳米凝胶薄膜
• 5.3.2 有机磷水解酶纳米凝胶/聚合物纤维复合材料
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 模型蛋白纳米凝胶多孔膜
• 6.1 引言
• 6.2 实验
• 6.2.1 实验原料，仪器，设备
• 6.2.2 模型蛋白纳米凝胶的制备
• 6.2.3 模型蛋白纳米凝胶多孔膜的制备
• 6.2.4 表征
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 第七章 全文总结
• 7.1 全文主要工作内容
• 7.2 本文主要创新点
• 致谢
• 发表的学术论文