论文摘要
【目的和意义】人类分娩的发动至今仍是个迷,我们对此的理解和所掌握的知识大部分处在猜想和推测阶段。早产是导致新生儿发病率和死亡率的主要病因。虽然目前有许多治疗方法,而且很多研究已经尝试新的治疗方案来阻止早产,但在过去三十年里早产的发病率并没有显著的变化。足月分娩和早产的发动机制仍然不为人类所知。但我们所能观察到是分娩发动和早产的第一步—子宫平滑肌的收缩。足月子宫平滑肌的收缩由许多生理信号所触发,这些信号最终通过子宫平滑肌细胞离子通道的调节使得子宫兴奋。大电导钙敏感钾通道（large-conductancecalcium-sensitive potassium channel,BKca）是人类妊娠和非妊娠子宫平滑肌细胞上最主要的钾通道,总外向钾电流的80%为BKCa电流。BKca是目前所知道的唯一通过膜去极化和增加细胞内Ca2+浓度而被激活的离子通道,它能使子宫平滑肌静息,在调节子宫平滑肌功能中起着枢纽的作用。平滑肌BKca由α亚单位和β亚单位组成的四聚体结构构成。α亚单位形成通道的孔道区,β亚单位是决定了通道Ca2+的敏感性。促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin-Releasing Hormone,CRH）是人类分娩时所特有的激素,近年来认为促肾上腺皮质激素释放激素是控制妊娠时间长短的“胎盘钟”。在妊娠初期母体血浆的CRH浓度很低,妊娠中期开始上升,分娩时显著增加。提高母体CRH水平会引起早产提示CRH可能参与了子宫平滑肌的收缩。然而,CRH又可通过增加子宫平滑肌细胞内的环磷腺苷,继发的减少细胞内钙的水平又起到使子宫静息的角色。CRH在妊娠的不同阶段,发挥着保持子宫静息和促进子宫收缩的双重作用。目前对BKca通道的调节因素还未研究完善,已有的研究提示PH值、还原电位、一氧化氮、花生四稀酸以及磷酸化作用可能对BKca有影响。孕期母体血CRH进行性升高,CRH是否对通过对BKca离子通道影响进而影响子宫平滑肌舒缩呢?所以,为了解子宫平滑肌细胞的BKca的表达情况是否受到CRH的调节,在实验室以往工作的基础上,设计进行了此研究,探讨CRH影响子宫舒缩的机制,期望为控制子宫平滑肌收缩提供一个靶点。【实验方法和统计学处理】:1、分离和培养人子宫平滑肌细胞:术中取少量足月临产（term labor,TL）及足月未临产（term non-labor,TNL）的子宫下段平滑肌,Ⅱ型胶原酶及DNA酶共同消化细胞并进行原代培养。2、反转录、实时定量多聚酶链反应:给予细胞不同浓度的CRH和CRH R1受体拮抗剂、R1受体拮抗剂、CRH广谱拮抗剂以及CRH拮抗剂和CRH的合剂作用24h后,利用上海华舜公司Trizol Reagent并按照制造商提供的方法,提取细胞的总RNA,利用Promega公司的反转录酶M-MLV,按制造商提供的方法,合成cDNA第一条链。设计合成actin（内参照）及BKcaα亚单位及β亚单位（目的基因）的引物,进行实时定量PCR,扩增BKcaα亚单位及β亚单位DNA双链,检测子宫平滑肌细胞BKcaα亚单位及β亚单位mRNA的相对表达量。3、统计学处理:以actin为内参照,将BKca与actin的cDNA和蛋白浓度的比值反映BKca的mRNA和蛋白的相对表达量。以SPSS 13.0进行统计。建立数据库后,统计、描述各组数据的均数、标准误并对数据进行方差齐性检验,若数据呈正态分布且方差齐性,则对其采用one way ANOVA,比较各组均数之间是否有差别;对于非正态分布或方差不齐的样本则采用非参数检验（Kruskal Wallis Test）。检验水准α=0.05。【结果】:1、联合使用胶原酶和DNA酶消化法可快速获得活力较好的子宫平滑肌细胞。2、足月未临产组（TNL）CRH及其受体拮抗剂作用24h后子宫平滑肌细胞中BKcaα亚单位mRNA的表达水平统计分析在未临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKCa通道α亚单位mRNA表达升高,各组之间有差异（p=0.047）。CRH处理组相互比较:两两比较,10-8mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异有统计学意义（p=0.015）;10-7mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异显著（p=0.003）;10-10mol/L和10-9 mol/L浓度的CRH与对照组相比,差异无统计学意义（p=0.073,0.266）。CRH R1及R2受体拮抗剂处理组与空白对照组相比,在单独给予CRH R1受体拮抗剂Antalarmin或CRH R2受体拮抗剂Astressin 2B后,BKCaα亚单位mRNA表达也上调,但此差异无统计学意义（p=0.558,0.084）。与CRH 10-9mol/L组对比,在给予CRH 10-9mol/L+Antalarmin 10-7 mol/L组和CRH 10-9mol/L+Astressin 2B 10-7mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9mol/L的效应,此结果也无统计学意义（p=0.050,0.901）。与空白对照组相比,R1受体拮抗剂溶剂DMSO使BKCaα亚单位mRNA表达也上调,此差异有统计学意义（p=0.022）。3、足月临产组（TL）CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCaα亚单位mRNA的表达水平统计分析在临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKCa通道α亚单位mRNA表达升高,但各组之间差异均无统计学意义（p=0.904）。CRH处理组相互比较:两两比较,10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L和10-7mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异无统计学意义（p=0.276,0.691,0.618,0.889）;CRH各浓度之间相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CRH广谱受体拮抗剂与空白对照组相比,在单独给予CRH广谱受体拮抗剂Astressin后,BKCaα亚单位mRNA表达也上调,但此差异无统计学意义（p=0.306）;与CRH 10-9 mol/L组对比,在给予CRH 10-9 mol/L+Astressin 10-8mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9mol/L的上调效应,结果无统计学意义（p=0.899）4、足月未临产组（TNL）CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCaβ亚单位mRNA的表达水平统计分析在未临产组,与空白对照组相比,各处理组对BKCa通道β亚单位mRNA表达差异无统计学意义（p=0.940）。CRH处理组相互比较:与空白对照组相比,10-10mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L浓度的CRH对BKCa通道β亚单位mRNA表达上调,但此差异无统计学意义（p=0.698,0.714,0.480）;与空白对照组（100±0）相比,10-9mol/L浓度的CRH使BKCa通道β亚单位mRNA表达下调,此差异无统计学意义（p=0.912）。CRH R1及R2受体拮抗剂处理组与空白对照组相比,在单独给予CRH R1受体拮抗剂Antalarmin或CRH R2受体拮抗剂Astressin 2B后,BKCaβ亚单位mRNA表达下调,但此差异无统计学意义（p=0.903,0.939）。与CRH 10-9mol/L组对比,在给予CRH 10-9mol/L+Antalarmin 10-7mol/L组和CRH 10-9mol/L+Astressin 2B 10-7mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9mol/L的上调效应,此结果也无统计学意义（p=0.282,0.496）。与空白对照组相比,R1受体拮抗剂溶剂DMSO使BKCaβ亚单位mRNA表达上调,此差异无统计学意义（p=0.562）。5、足月临产组（TL）CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCaβ亚单位mRNA的表达水平统计分析在临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKCa通道β亚单位mRNA表达有统计学意义（p=0.027）。CRH处理组相互比较:两两比较,10-8mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,使BKCa通道β亚单位mRNA表达下调,差异有统计学意义（p=0.045）;10-7mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异有统计学意义（p=0.032）;10-10mol/L和10-9mol/L浓度的CRH与对照组相比,差异无统计学意义（p=0.781,0.864）。CRH广谱受体拮抗剂与空白对照组相比,在单独给予CRH广谱受体拮抗剂Astressin后,BKCaβ亚单位mRNA表达上调,但此差异无统计学意义（p=0.655）;与CRH 10-9mol/L组对比,在给予CRH 10-9mol/L+Astressin 10-8 mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9mol/L的上调效应,结果无统计学意义（p=0.653）【结论】:1、人足月妊娠子宫平滑肌细胞BKCa的表达受到一定浓度范围(10-8mol/L～10-7mol/L)CRH的调节。2、CRH对子宫平滑肌BKCa起着双重调节作用:足月未临产时CRH能上调BKCaα亚单位,发挥维持子宫静息作用。足月临产时下调BKCaβ亚单位,使得BKCa静息功能减弱或消失,可能引发了子宫的收缩。
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