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Cyt b-559α链Arg～（18）和Ser～（24）的定点突变及其对PSII功能的影响

2020-11-23阅读(718)

Cyt b-559α链Arg～（18）和Ser～（24）的定点突变及其对PSII功能的影响

论文摘要

Cyt b-559是光系统II反应中心的成分之一,它由α亚基和β亚基组成的。在Cyt b-559中,血红素辅基与两个亚基中的组氨酸连接成有功能的蛋白,并维持PSII的功能稳定性。前人曾将与血红素相连的His突变,导致Cyt b-559功能和PSII稳定性的丧失。基于此研究,本文采用定点突变技术,将α亚基中与His23位置最近的上游氨基酸Arg18分别用Gly和Glu取代,下游氨基酸Ser24用Phe取代,获得了衣藻Cyt b-559的突变体。对突变体的分析,有以下新结果:突变体都能进行光合自养,但无论在异养培养基上还是自养培养基上,和对照相比,其生长速度非常缓慢; PSII的活性分析,表明PSII的放氧活性为野生衣藻细胞的50%～80%, Fv/Fm的荧光参数为40%～70%;对突变体进行强光（1000μE·m-2·s-1）照射,10min后,其放氧活性都降低为0,而野生型衣藻还保持35%的活性;提取类囊体膜蛋白,进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,显示突变体的膜蛋白与对照无显著差异。这些结果说明对围绕血红素环境的固有氨基酸的改变,虽然并没有明显影响类囊体膜蛋白的表达和组成,但是却影响了衣藻细胞的生长和PSII的活性,增加了衣藻细胞对强光的敏感性,降低了衣藻细胞自身的光保护能力。这说明靠近血红素配位环境的氨基酸Arg和Ser,尤其是Arg,对Cyt b-559的功能维持不可缺少,对于维持PSII的活性也很重要。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩写词
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 Cyt b-559 的结构与功能及其研究进展
  • 一、Cyt b-559 的结构与性质
  • 1、蛋白和基因
  • 2、 Cyt b-559 的其它组分
  • 3、物理化学特性
  • 4、Cyt b-559 的生物进化特征
  • 5、Cyt b-559 在PSII 反应中心内的位置
  • 二、Cyt b-559 的功能
  • 1、Cyt b-559 在PSII 电子传递中的作用
  • 2、Cyt b-559 在水氧化中的作用
  • 3、Cyt b-559 的FQR 功能
  • 4、Cyt b-559 的超氧化物歧化酶活性
  • 5、Cyt b-559在PSII组装中的作用
  • 6、Cyt b-559 的质体醌氧化酶的作用
  • 三、研究Cyt b-559 的热门方法
  • 1、EPR 谱
  • 2、共振拉曼光谱和傅立叶变换红外光谱
  • 3、穆斯堡尔谱
  • 4、时间分辨光谱技术
  • 5、分子生物学方法
  • 第二节 衣藻及其叶绿体遗传转化研究
  • 一、衣藻的基本结构及其功能
  • 1. 细胞壁
  • 2. 细胞核和核基因组
  • 3. 叶绿体和叶绿体基因组
  • 4、其它结构
  • 二、衣藻的叶绿体转化研究
  • 1、叶绿体转化
  • 2、衣藻叶绿体转化
  • 三、衣藻的光合研究进展
  • 第三节 定点突变技术及其在Cyt b-559 研究中的应用
  • 一、基于PCR的点突变
  • 二、PCR介导的随机突变
  • 三、PCR诱变法与其他诱变法的比较
  • 四、点突变所用寡核苷酸的设计特点
  • 五、通过突变研究蛋白质功能的原则
  • 六、结论
  • 七、突变技术在Cyt b-559功能研究中的应用
  • 第二章 本论文的立题依据、目的和意义及拟采取的技术路线
  • 一、立题依据、目的及意义
  • 二、拟采取的技术路线
  • 第三章 材料与方法
  • 第一节 实验材料
  • 一、植物材料
  • 二、菌株和质粒
  • 三、使用的药品和常用试剂
  • 第二节 实验方法
  • 一、质粒DNA 的小量提取（碱裂解法 ）
  • 二、质粒的大量提取
  • 三、酶切，连接反应
  • 四、DNA 的回收纯化
  • 五、大肠杆菌感受态的制备
  • 六、质粒DNA 的转化
  • 七、利用大引物突变法进行定点突变
  • 八、基因枪微弹轰击衣藻叶绿体转化
  • 九、转化后衣藻的过渡培养
  • 十、基因转化后衣藻的筛选培养
  • 十一、衣藻DNA的提取
  • 十二、Southern 杂交（地高辛标记法）
  • 十三、衣藻类囊体膜蛋白多肽组分的样品处理
  • 十四、衣藻类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
  • 十五、Western 杂交
  • 十六、衣藻突变体的生长速率的测定
  • 十七、叶绿素含量测定
  • 1、衣藻细胞中的叶绿素测定
  • 2、类囊体膜蛋白的叶绿素测定
  • 十八、吸收光谱的测定
  • 十九、放氧速率的测定
  • 二十、衣藻荧光动力学参数的测定
  • 二十一、强光照射的实验方法
  • 第四章 结果与分析
  • 第一节 突变载体构建前的准备
  • 第二节 衣藻Cytb-559α链的定点突变
  • 一、突变体R18G的载体构建
  • 二、突变体R18E 的载体构建
  • 三、突变体S24F的载体构建
  • 第三节 衣藻Cyt b-559α链突变体R18G 和R18E 的筛选、分子鉴定和生理生化分析
  • 一、衣藻突变体R18G 和R18E 的抗生素筛选
  • 二、衣藻突变体R18G 和R18E 的分子鉴定
  • 三、衣藻突变体R18G 和R18E 类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-PAGE、Western blotting和吸收光谱
  • 四、衣藻野生型和突变体R18G 和R18E 生长速度比较
  • 五、衣藻突变体R18G和R18E的荧光参数的测定
  • 六、衣藻突变体R18G和R18E的PSII放氧活性的测定
  • 七、衣藻突变体R18G 和R18E 对强光的敏感性
  • 第四节 衣藻Cyt b-559α链突变体524F 的筛选、分子鉴定和生理生化分析
  • 一、衣藻突变体524F的抗生素筛选
  • 二、衣藻突变体524F的分子鉴定
  • 三、衣藻突变体524F 类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-PAGE、Western blotting 和吸收光谱
  • 四、衣藻野生型和突变体524F生长速度的比较
  • 五、衣藻突变体524F 的荧光参数和PSII 放氧活性的测定
  • 六、衣藻突变体524F对强光的敏感性
  • 第五节 讨论
  • 18和Ser24的突变对衣藻细胞生长的影响'>一、Cyt b-559 α链中Arg18和Ser24的突变对衣藻细胞生长的影响
  • 18和Ser24的突变对PSII活性的影响'>二、Cyt b-559 α链中Arg18和Ser24的突变对PSII活性的影响
  • 18和Ser24的突变对其光保护功能的影响'>三、Cyt b-559 α链中Arg18和Ser24的突变对其光保护功能的影响
  • 18和Ser24的突变影响其功能的机理推测'>四、Cyt b-559 α链中Arg18和Ser24的突变影响其功能的机理推测
  • 第五章 结论及未来工作展望
  • 一、结论
  • 二、今后工作的设想
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

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