玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）生理分化和遗传多态性研究

论文摘要

本论文从寄主-病原菌互作角度,采用性状培养、Ht单基因鉴别寄主鉴定技术、同工酶电泳技术、扩增片段长度多态性分析技术（AFLP）和血清学技术,系统研究了我国玉米大斑病菌（Exerohilum turcicum）生理分化和遗传多态性。本研究从我国玉米大斑病菌生理小种组成和种群变化等方面,全面分析了近年来我国玉米大斑病危害加重的原因。采用两套Ht单基因（Ht1、Ht2、Ht3和HtN）鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204株玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定,共鉴定出0、1、2、3、12、13、23、123和23N等9个生理小种,其中0号和1号生理小种为优势小种,分别占供试菌株的62.25%和19.12%。毒力频率分析结果表明,玉米大斑病菌小种组成对Ht1抗性基因的毒力频率最高,为33.33%;对HtN抗性基因的毒力频率最低,为1.47%。Ht1和Ht2抗性基因在我国玉米产区均有不同程度的抗性“丧失”。玉米大斑病菌不断有新小种出现,生理分化明显。生理小种组成较复杂的省份为东北三省、河北和四川等地区。本研究从病原物的环境适应性、同工酶和DNA多态性等方面,系统探讨了导致病原菌生理小种变异的生理和分子生物学机制。利用继代培养、连续接种和rDNA ITS序列比较,探明了在稳定的寄主选择压力条件下,玉米大斑病菌生物学特征、致病性和rDNA-ITS序列是相对稳定的,rDNA-ITS序列同源性达96.9%～100%。在培养性状方面,玉米大斑病菌不同生理小种间菌落形态、菌丝生长速度、产孢量、孢子萌发和菌落产色素能力均存在明显的多态性。在同工酶方面,玉米大斑病菌不同生理小种在6种同工酶水平上均表现出不同程度的多态性,其中酯酶（EST）、超氧化物歧化酶（SOD）的多态性尤为明显。这种同工酶水平上的多态性,反映了病原菌遗传表达的多态性。在DNA遗传多态性方面,采用扩增片断长度多态性分析技术（AFLP）分析了玉米大斑病菌的遗传变异,供试菌株间遗传相似系数在0.6～1.0之间,表现出明显的遗传多态性。聚类结果表明,该病菌的遗传多态性与其生理分化存在明显相关性。但不同地域的同一生理小种的菌株相似系数达到了1.00,说明其生理分化与地域无关。在玉米大斑病菌生理小种辅助鉴定方法的研究方面,本研究首次利用AFLP特异条带序列设计,筛选出玉米大斑病菌生理小种的特异引物,引物组合可以为0、13号等生理小种鉴定提供准确的分子生物学辅助鉴定。在病原菌遗传多态性的基础上,首次利用免疫学方法制备了玉米大斑病菌1、2、12、13号生理小种的抗血清,在提高抗血清稀释度的情况下,经效价、交叉反应、ELISA和Western blot试验,发现1、12号生理小种菌株的抗血清表现出小种特异性。本研究完成了辽宁省主栽玉米品种对玉米大斑病菌生理小种的抗性鉴定。各品种对不同生理小种的抗病性存在明显差异,其中高抗品种占17.86%,中抗至抗的品种占53.57%。抗病性鉴定结果与品种系谱相关性分析表明,品种对不同生理小种的抗性与品种血缘关系相关。另外,气候条件对抗病性鉴定结果亦有影响。综合上述研究结果:玉米大斑病菌存在明显的生理分化。新小种的出现及其种群数量的上升和某些垂直抗病品种抗性的“丧失”是玉米大斑病逐年加重的重要原因。寄主更换的选择压力变化和病原菌种群内的遗传多态性是玉米大斑病菌发生变异的重要原因。AFLP和免疫学技术可以作为玉米大斑病菌生理小种的辅助鉴定技术。辽宁省主栽品种对玉米大斑病菌主要优势小种表现出较好的抗性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 玉米大斑病和玉米主要病原菌生理分化研究进展
• 第一节 玉米大斑病研究进展
• 第二节 玉米主要病害病原菌生理分化研究
• 第三节 植物病原真菌生理分化研究技术
• 第二章 我国玉米大斑病菌生理小种种群动态分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 玉米大斑病病斑特征
• 2.2 玉米大斑病菌生理小种类型及其出现频率
• 2.3 玉米大斑病菌对Ht抗性基因的毒性频率及各小种在我国的分布
• 3 小结
• 第三章 玉米大斑病菌不同生理小种菌株间生物学比较
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同培养基上的性状比较
• 2.2 营养条件对菌丝生长的影响
• 2.3 环境因子对菌丝生长的影响
• 2.4 环境条件对病菌产孢量的影响
• 2.5 环境因子对病菌孢子萌发的影响
• 3 小结
• 第四章 玉米大斑病菌遗传多态性研究
• 第一节 玉米大斑病菌培养性状和致病力稳定性
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 玉米大斑病菌培养性状观察
• 2.2 玉米大斑病菌分生孢子形态观察
• 2.3 玉米大斑病菌致病力的稳定性
• 3 小结
• 第二节 玉米大斑病菌和玉米小斑病菌rDNA-ITS序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 rDNA-ITS序列PCR扩增结果
• 2.2 玉米大斑病菌和玉米小斑病菌rDNA-ITS序列比对分析
• 2.3 玉米大斑病菌和玉米小斑病菌系统发育分析
• 3 小结
• 第三节 玉米大斑病菌生理小种AFLP遗传多态性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 AFLP反应体系的构建
• 2.1.1 DNA模板的浓度
• 2.1.2 酶切时间
• 2.1.3 预扩增模板浓度
• 2.1.4 选择性扩增、电泳和银染
• 2.2 AFLP引物筛选
• 2.3 玉米大斑病菌AFLP遗传多态性分析
• 2.3.1 AFLP扩增结果分析
• 2.3.2 玉米大斑病菌AFLP遗传多态性及聚类分析
• 2.4 玉米大斑病菌AFLP多态性条带测序及引物设计
• 2.5 玉米大斑病菌生理分化多态性谱带引物筛选
• 3 小结
• 第四节 玉米大斑病菌生理小种同工酶遗传多态性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 同工酶图谱分析
• 2.2 同工酶水平上的相似性及聚类分析
• 3 小结
• 第五章 玉米大斑病菌生理小种的免疫学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白质电泳图谱分析
• 2.2 多克隆抗体性质的测定
• 2.3 多克隆抗体特异性反应
• 3 小结
• 第六章 辽宁省部分主栽玉米品种对大斑病菌生理小种的抗病性鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 2007年玉米品种的抗性鉴定
• 2.2 2008年玉米品种的抗性鉴定
• 3 小结
• 第七章 结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 论文图表统计