炎症、糖基化终末产物、葡萄糖及胰岛素对单核—巨噬细胞系THP-1细胞功能的影响

论文摘要

背景与目的：近年来,糖尿病（diabetes mellitus，DM）的炎症病因学理论倍受关注，该理论认为DM患者体内普遍存在慢性低度炎症反应（Chronic low-gradeinflammatory disease），并且这种低度炎症反应还在进一步加重DM，并促进一些临床并发症的出现，具体表现在胰岛素抵抗的加重、高血压的恶化、动脉粥样硬化等心血管疾病的出现以及慢性肾脏病的进展等。其中，巨噬细胞在天然免疫系统中发挥着重要的防御作用，而巨噬细胞活化平衡也是决定炎症转归的关键。在2型糖尿病发展过程中，高糖，高胰岛素血症及糖基化终末产物（advanced glycationend product, AGE）等微环境引起胰岛素源性的炎性因子分泌增加，促使巨噬细胞活化分泌大量炎性因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等，加剧氧化应激，引起组织损伤。近来，旨在研究危重病人血糖控制的NICE-SUGAR研究及预防糖尿病心血管事件的ACCORD研究均没有发现实现血糖正常化可减少全因死亡。本实验从慢性低度炎症的视角出发，用人急性单核细胞白血病细胞株THP-1所诱导的巨噬细胞作为研究的模型，来研究不同葡萄糖、胰岛素和AGE浓度状态下及外源性炎性因子脂多糖对中性粒细胞的吞噬功能和ROS产量的影响，以探索炎症状态下AGE、葡萄糖、胰岛素对单核细胞氧化应激及吞噬能力的影响。方法：1.细胞培养人类急性单核细胞白血病细胞株THP-1（由上海细胞库提供）。将THP-1细胞置入含有的10%胎牛血清的RPMI1640（5.0mmol/L葡萄糖）培养液中，放置于37℃，5%CO2的孵育箱中培养。并在对数生长期收获细胞，使细胞达到同步化后加入不同的实验处理因素。2.实验分组（1）用终浓度为160nmmol/L的PMA诱导生长良好的THP-1细胞72h，使其分化成巨噬细胞。（2）本实验分别用不同水平的葡萄糖浓度对THP-1细胞进行培养（5.0、8.0、10.0、15.0、20.0和25mmol/L），细胞于37℃，5%CO2的孵育箱中培养72h后，收获细胞。（3）实验各组细胞再分别用不同浓度的胰岛素进行对抗（0mIU/L、20mIU/L、50mIU/L、200mIU/L和1000mIU/L），细胞于37℃，5%CO2的孵育箱中培养24h后收获细胞。（4）体外人工孵育AGE-BSA，以培养的THP-1细胞为模型,首先将细胞随机分成两组，第一组加入一定蛋白浓度的BSA（终浓度为100ug/ml）作为对照组处理48h；第二组分别加入不同蛋白浓度的AGE-BSA（终浓度为50、100、200、400ug/ml）处理48h后收获细胞。（5）实验各组细胞置于有外源性炎症刺激因子LPS（1μg/ml）和无LPS（0μg/ml）的条件中，刺激24h后收获细胞，检测THP-1细胞的吞噬的功能和氧化应激ROS产生的多少情况并进行多因素的析因设计方差分析进行组间及组内的比较，结果进行比较。结果：1.葡萄糖、AGE、胰岛素及LPS对THP-1细胞ROS释放的影响（1）THP-1细胞产生ROS的能力从葡萄糖浓度5.0mmol/L至25.0mmol/呈上升的趋势。（2） THP-1细胞产生ROS的能力从AGE浓度50mg/L至400.0mg/L呈逐步上升的趋势。（3）THP-1细胞在胰岛素浓度20.0mu/L与对照组相比，产生ROS的能力是降低的。从胰岛素浓度20.0mu/L至1000.0mu/L呈显著上升的趋势。（4）当培养液内有葡萄糖与1μg/ml脂多糖（LPS）共同培养时，细胞产生ROS的能力在各葡萄糖浓度均显著增加，其中在15mmol/L的糖浓度水平ROS的释放量达最高值。（5）当培养液内有胰岛素与1μg/ml脂多糖（LPS）共同培养时，细胞产生ROS的能力在各胰岛素浓度均显著增加。（6）当培养液内有AGE与1μg/ml脂多糖（LPS）共同培养时，细胞产生ROS的能力虽然和对照组比较是增加的，但是与LPS加入前没有差异。2.葡萄糖、AGE、胰岛素和LPS对THP-1细胞吞噬功能的影响（1）THP-1细胞吞噬功能从葡萄糖5.0mmol/L到10.0mmol/L无改变，但在葡萄糖15mmol/L时降至最低值，20mmol/L和25mmol/L的吞噬功能也较低。（2） THP-1细胞的吞噬能力在各AGE浓度较对照组有明显的下降。（3）THP-1细胞吞噬功能从胰岛素20mu/L和50mu/L无改变，但在200mu/L和1000mu/L的吞噬功能下降。（4）予1μg/ml脂多糖（LPS）刺激后，THP-1细胞的吞噬功能在葡萄糖浓度为5mmol/L时最强，细胞吞噬功能从葡萄糖浓度5.0mmol/L至20.0mmol/L虽较刺激前上升，但和5mmol/L比较升高并不明显。（5）当培养液内有胰岛素与1μg/ml脂多糖（LPS）共同培养时，细胞产生吞噬能力能力均显著增加。（6）予1μg/ml脂多糖（LPS）刺激后，细胞吞噬功能AGE浓度50mg/L至400.0mg/L普遍低下。结论：1. LPS与AGE均作为炎性因子刺激巨噬细胞活化，参与炎症反应，加重血糖和胰岛素对巨噬细胞功能影响过程。2.胰岛素在生理浓度下，发挥其抗炎作用；但胰岛素抵抗时的浓度，损伤细胞功能。3.通过本实验数据观察，5.0～10.0mmol/L血糖水平范围可能是机体对血糖的最佳耐受能力，有利于发挥细胞的生理功能。从而提示对糖尿病血糖治疗的可接受的血糖控制范围。

论文目录

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• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
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