神经致幻型毒菌205（Psilocybe sp.）的初步鉴定及生物学特性研究

论文摘要

205新菌株(Psilocybe sp.)取自本实验室,是贺新生等人由野生子实体经组织分离所得,其分类地位是属于担子菌亚门、伞菌目、球盖菇科、裸盖伞属。根据文献资料报道,裸盖伞属中有很多种类是产生神经致幻型毒菌,具有很大的研究和开发价值。 在研究205的过程中,发现205是由纯205和点枝顶孢(Acremonium strictum W. Cams.)混生在一起的混合菌株。本实验通过单孢分离法和菌丝片段分离法两种分纯方法对205进行了分纯。实验证明,菌丝片段分离法效果良好。通过依次稀释、转管,借助于显微观察将205及其混生菌分离开来,205的菌丝有锁状联合,在琼脂培养基上有子实体扭结现象,其混生菌丝为点枝顶孢,没有锁状联合,有分生孢子及分生孢子器。对205的成功分纯,为205菌种的鉴定奠定了基础。 传统的形态学分类方法是分类和鉴定的基础。通过对纯化的205进行平板培养、平板插片培养,描述了205的菌落特征,菌丝特征及子实体等宏观上的形态特征,通过显微观察和扫描电镜的应用,描述了菌褶、担子和担孢子、菌丝的锁状联合等微观特征。 核糖体RNA(rRNA)是细胞中最古老的分子之一,具有结构、功能和进化的同源性。编码其rRNA前体的基因即rDNA,它是基因组DNA中中等重复并有转录活性的基因家族。本身具有进化的高度保守性,同时又富含高可变区域,成为较为理想的菌种鉴定及系统学研究对象。本文通过核糖体rDNAITS序列进行PCR扩增,经纯化后克隆转化,双酶切验证后直接测序,运用相关序列分析软件对ITS区全序列进行分析,并和Genbank中的已有种进行BLAST同源性比对,发现与序列号为AB158634的Psilocybe coprophila的同源性最高,为99%。 经典的形态分类学方法是分类和鉴定的基础,分子遗传学作为鉴定的辅助手段。本文将传统的分类学方法结合分子生物学方法相结合,首次鉴定205为裸盖伞属中的可能为一新种。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究综述
• 1 有关毒菌
• 2 神经致幻型毒菌
• 2.1 神经致幻型毒菌的种类与分布
• 2.2 神经致幻型毒菌的研究和人工驯化
• 2.3 神经致幻型毒的应用
• 3 真菌的分类研究
• 3.1 传统的真菌分类
• 3.2 核酸技术在真菌分类与鉴定中的作用
• 3.2.1 研究对象
• 3.2.2 DNA分子标记技术
• 3.2.3 序列测定
• 3.2.4 分子性状的定量计算与进化树构建
• 4 有关裸盖伞
• 4.1 裸盖伞的分类地位
• 4.2 裸盖伞的种类及分布
• 4.3 裸盖伞物种的特征
• 4.4 目前对裸盖伞研究存在的问题
• 5 本论文立题意义及研究的主要内容
• 第二章 菌种的初步鉴定
• 第一节 205及其混生菌的分离纯化
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试培养基
• 1.3 分离前的主要工作
• 1.4 分离纯化方法
• 1.5 菌落培养观察
• 1.6 菌丝体制样及染色
• 1.7 染样镜检及显微照相
• 2 结果
• 2.1 利用菌丝片段分离法分纯的结果
• 2.2 纯培养物的菌落特征
• 2.2.1 205的菌落特征
• 2.2.2 点枝顶孢的菌落特征
• 3 讨论
• 3.1 确定为205的依据
• 3.2 菌丝片段分离法的原理
• 3.3 单孢分离法对同属中其他种类的影响
• 第二节 经典分类学方法鉴定205
• 1 材料与方法
• 1.1 研究材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养皿特征观察
• 1.2.2 子实体特征观察
• 1.2.3 超微结构观察
• 1.2.4超微结构的观察
• 2 结果
• 2.1 菌丝形态特征
• 2.2 子实体特征
• 2.3 显微结构和扫描电镜结果
• 3 讨论
• 第三章 205的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 菌丝体培养
• 1.3 仪器设备
• 1.4 试剂盒
• 2 研究方法
• 2.1 205基因组DNA的提取
• 2.2 ITS区域特异性PCR扩增
• 2.2.1 引物及引物序列
• 2.2.2 PCR扩增体系
• 2.2.3 PCR产物的凝胶回收纯化
• 2.3 PCR产物的T／A克隆和转化
• 2.3.1 克隆体系
• 2法制备感受态细胞'>2.3.2 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.3.3 转化
• 2.4 PCR验证重组质粒
• 2.5 PCR扩增产物测序
• 3 结果与讨论
• 3.1 PCR扩增结果分析
• 3.2 菌落PCR验证插入片段大小
• 3.3 双酶切验证阳性克隆
• 3.4 DNA序列数据的分析
• 3.5 BLAST分析
• 4 本章小结与讨论
• 第四章 纯化205的生物学特性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 仪器设备
• 1.3 培养基
• 2 菌丝体生长量的测定方法
• 2.1 测菌丝干重
• 2.2 测平板菌丝直径
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 最适温度的确定
• 2.3.2 最适初始pH的确定
• 2.3.3 最佳氮源的确定
• 2.3.4 最佳碳源的确立
• 2.3.5 最佳碳氮比（C／N）的研究
• 2.3.6 无机盐对菌丝体生长的影响
• 3 结果
• 3.1 最适生长温度
• 3.2 最适pH
• 3.3 最适氮源
• 3.4 最适碳源
• 3.5 最佳碳氮比（C／N）的研究
• 3.6 四种无机盐对菌丝体生长的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表文章