AQP5对人呼吸道黏膜下腺细胞水跨膜通透性及粘蛋白合成、分泌影响的研究

论文摘要

目的 旨在探讨质粒介导的短发夹状RNA（shRNA，short hairpin RNA）对人呼吸道粘膜下腺细胞（SPC-A1）水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）表达的抑制。方法 用免疫荧光双标法检测AQP5和MUC5AC在SPC-A1细胞上的表达。构建能在哺乳动物细胞内表达shAQP5重组质粒，转染SPC-A1细胞。用荧光定量PCR检测mRNA的表达，用FACS和Western杂交检测蛋白表达。结果 AQP5和MUC5AC在SPC-A1上均有表达。与未转染组（Con）和无关转染组（shNeg）比较，shAQP5组细胞AQP5 mRNA表达在转染后1、2天明显降低，3-7天mRNA水平有轻度回调，而蛋白的明显抑制出现在转染后第5天。结论 质粒介导的短发夹RNA（shRNA）可有效抑制人呼吸道黏膜下腺细胞膜AQP5的表达，AQP5蛋白水平的抑制滞后于mRNA水平。若能将RNA干扰用于AQPs的其它亚型将拓展AQPs生理功能的研究。 目的 shRNA介导的AQP5的抑制是否影响SPC-A1细胞渗透压驱动的水跨膜通透性。方法 细胞分3组即Con组，shNeg组，shAQP5组。用标记胞浆的荧光染料Calcein-AM负载SPC-A1细胞，激光共聚焦显微镜实时监测不同渗透压溶液灌流时的荧光变化曲线，根据公式计算各组渗透压驱动的水通透系数（Osmotic water permeability coefficient，Pf）。将细胞较长时间置于低渗液中，观察各组细胞调节性体积收缩（Regulated volume decrease，RVD）现象的异同。结果 用5个系列梯度的Calcein-AM负载细胞多次灌流实验均未观察到SPC-A1细胞的Calcein-AM淬灭现象。荧光强度与细胞体积的关系为：随着滲透压增高，细胞体积缩小，荧光强度增强；滲透压降低，细胞体积增大，荧光强度减弱。shAQP5组细胞灌流高滲液后荧光强度的上升支较Con组和shNeg组缓慢，根据公式计算的Pf为0.8×10-2cm／s，与Con组比较下降49.4％。shAQP5组细胞的RVD时间明显延长，最大回缩能力为85％，较Con组和shNeg组明显降低。结论共聚焦显微镜可实时监测荧光强度和细胞体积，是研究水跨膜转运的理想方法。AQP5抑制后可明显降低SPC-A1细胞渗透压驱动下水的通透性，还可影响细胞在低滲环境中的调节性体积回缩能力。 目的 AQP5下调是否影响人呼吸道黏膜下腺细胞粘蛋白（MUC5AC）的合成和分泌，若两者确实存在某种调节关系，则进一步探讨AQP5和MUC5AC之间调控的分子机制。方法 构建能在体内表达针对AQP5的短发夹状RNA（shAQP5）的重组质粒。用G418筛选稳定转染shAQP5的细胞克隆。MUC5ACmRNA及蛋白表达水平用Real-time PCR及Western杂交检测。用ELISA法检测3组细胞（Con，shNeg，shAQP5）上清及裂解液中MUC5AC的合成和分泌。用激光共聚焦显微镜检测静息及激发状态细胞内钙离子浓度的变化。3组细胞PKC及p-PKC水平差异用Western杂交检测。结果 G418处理1.5月后，筛出的5个稳转株经PCR和测序鉴定证实插入序列已整合在细胞基因组上。pShAQP5瞬时转染3～4天，MUC5AC mRNA分别增高120％和65.7％，ELISA显示瞬转第5天，MUC5AC的合成和分泌分别增加57.9％、85.3％。在5株稳定转染细胞中（shAQP5-G1，G2，G3，A1，A5）MUC5AC mRNA分别升高118％，165％，65％，123％和38％。ELISA检测MUC5AC的合成和分泌分别增加59-156％及33.166％。shAQP5组的[Ca2+]i在静息状态与Con组无明显变化，但pilocarpine激发下明显增高。shAQP5组细胞PKC水平与Con组比较无明显变化，但p-PKC的表达呈时间依赖性升高。结论 AQP5抑制可上调SPC-A1细胞MUC5AC的合成和分泌，并可能是通过Ca2+—PKC信号通路启动核转录因子，从而增强MUC5AC的转录。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写索引
• 前言
• 第一部分 质粒介导的shRNA对人呼吸道黏膜下腺细胞AQP5表达的抑制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 shAQP5抑制对渗透压驱动的水跨膜通透性影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 shAQP5抑制对SPC-Al细胞粘蛋白合成、分泌的影响及调控机制的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述一:肺、胸膜水通道蛋白的生理功能及其调控机制研究进展
• 综述二:气道黏液高分泌与上皮通道蛋白关系的研究进展
• 博士期间发表论文
• 致谢