论文摘要
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,可发生在结直肠的任何部位,其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势,已成为导致患者死亡的三大癌症之一。结直肠癌多转移至肝脏,因此30-40%的患者在疾病的早期就伴有肝转移;而在疾病晚期,95%的患者都出现肝转移,并且结直肠癌患者的死亡原因多可归咎于肝部转移灶的发展。随着肿瘤干细胞理论的提出,越来越多的研究提示肿瘤干细胞是肿瘤发生,发展以及转移复发的源泉。近期研究又发现肿瘤干细胞群也并不是均质的,而是存在有两个亚群,即静止肿瘤干细胞（stationary cancer stem cells, SCSC）和转移肿瘤干细胞（mobile cancer stem cells, MCSC）。前者仅具有成瘤性,不能播散,而后者同时具有成瘤性和侵袭性,促进恶性肿瘤的侵袭和转移。我们推测结肠癌中也存在这样一个细胞亚群,在结肠癌肝转移过程中扮演重要的角色。趋化因子在癌症转移中扮演着重要角色,具体机制是依据趋化/归巢理论,器官生成和分泌特异趋化因子,吸引近处或远处的表达相应受体的肿瘤细胞向其趋化。其中经证实SDF-1/CXCR4轴对许多实体瘤的局部侵袭和远处转移有重要作用。本课题欲探讨CXCR4表达是否与结肠癌中转移肿瘤干细胞相关。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）,是上皮细胞获得间质表型向间质细胞转化的现象。该过程在许多物种的胚胎发育过程中的重要阶段是必不可少的。近期研究发现,EMT是肿瘤发展过程中一个重要现象,肿瘤细胞通过发生EMT以具有更强的侵袭能力以促进肿瘤的侵袭和转移。由于与静止肿瘤干细胞相比,转移肿瘤干细胞具有迁移侵袭能力,因此在本课题中我们将进一步探讨EMT是否作为可能机制参与其中。基于以上,本课题分为两个部分展开研究:第一部分CD133+CXCR4+肿瘤细胞在结肠癌肝转移中的作用;第二部分EMT是参与CD133+CXCR4+肿瘤细胞促进结肠癌肝转移的可能机制。第一部分CD133+CXCR4+肿瘤细胞在结肠癌肝转移中的作用本课题的第一部分,我们首先通过流式细胞仪检测结肠癌、结肠癌肝转移组织中CD133+细胞以及CD133+CXCR4+细胞的比例,结果显示CD133+细胞和CD133+CXCR4+细胞在肝转移癌中都发生了富集,且CD133+CXCR4+细胞富集程度更高,提示它们都参与了结肠癌肝转移的发生。我们假设CD133+CXCR4+肿瘤细胞作为转移干细胞促进了肝转移发生,为了验证这一假设,我们应用了人结肠癌细胞系HCT116和裸鼠远处转移模型。经流式细胞仪分选出各表型细胞后经尾静脉注射裸鼠体内,结果显示并非所有CD133+肿瘤干细胞是肿瘤转移的源泉,而只是其中的一部分细胞,即同时表达CXCR4的肿瘤干细胞引起结肠癌的转移。接着,我们进行了克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验,比较CD133+CXCR4-细胞和CD133+CXCR4+细胞的克隆形成能力和裸鼠皮下成瘤能力。结果显示,CD133+CXCR4-和CD133+CXCR4+两种细胞的克隆形成能力和裸鼠皮下成瘤能力没有差异,提示CD133+CXCR4+细胞造成结肠癌肝转移的现象并不是由于这小群肿瘤干细胞具有更强的成瘤能力,而是通过其他机制实现的。第二部分EMT是参与CD133+CXCR4+细胞促进结肠癌肝转移的可能机制。?第二部分主要探讨了CD133+CXCR4+细胞是通过何种机制获得其转移侵袭的能力。由于EMT与肿瘤的转移侵袭密切相关,我们首先用real time RT-PCR检测了EMT相关基因的表达,并用transwell迁移和侵袭实验比较两个细胞亚群的迁移和侵袭能力,结果提示与CD133+CXCR4-细胞相比,CD133+CXCR4+细胞发生了EMT,并且具有更强的迁移和侵袭性。其次,经real time RT-PCR和transwell侵袭实验显示SDF-1可进一步诱导CD133+CXCR4+细胞发生EMT,提高其侵袭能力。最后,我们应用了经脾接种结肠癌细胞进行裸鼠肝转移实验,结果显示CD133+CXCR4-肿瘤细胞不能在肝上形成转移灶,而CD133+CXCR4+肿瘤细胞可形成转移灶,并用CXCR4拮抗剂-AMD3100干扰SDF-1/CXCR4轴可抑制结肠癌肝转移的发生。这部分实验结果为结肠癌转移的有效治疗提供了新的方向。综上所述,我们得出以下结论:1.结肠癌肿瘤干细胞中存在两种亚群,即静止肿瘤干细胞（CD133+CXCR4-细胞）和转移肿瘤干细胞（CD133+CXCR4+细胞）,且在结肠癌肝转移中起主要作用的是CD133+CXCR4+转移肿瘤干细胞。2. EMT参与了CD133+CXCR4+结肠癌细胞获得转移侵袭能力的过程;干扰SDF-1/CXCR4轴可抑制结肠癌肝转移的发生。