大麦黄矮病毒运动蛋白影响植物生长发育的分子基础

论文摘要

大麦黄矮病毒（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是黄症病毒属（Luteovirus）的代表成员,该病毒依靠介体蚜虫传播、扩散而引起大麦、小麦、燕麦等多种禾谷类作物的黄矮病[1]。病毒在植物体内的传播需要17 kDa的运动蛋白（movement protein,MP）。本论文主要开展了两方面的研究:1.BYDV-MP的生化特性研究。构建了原核表达载体pET30a-MP,转化表达菌株BL21（DE3）pLysS,0.4 mM IPTG诱导得到与组氨酸标签的的融合蛋白,分子量约20kDa的MP。Western-blot检测到两条带,20 kDa和40 kDa,推测40 kDa是MP的同源二聚体,对20 kDa的MP切胶回收、透析纯化复性,同样检测到两条带,证实了MP的体外二聚化。构建酵母穿梭载体pGADT7-MP,进行自激活和毒性检测后,将pGADT7-MP、pGBKT7-MP共转化酵母AH109感受态细胞,铺在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His选择性培养基上,检测到相互作用的发生。利用酵母双杂交实验得出的结果与原核表达结果一致。表明MP可以在体内形成同源二聚体。2.利用转基因技术研究BYDV-MP对植物生长发育的影响。前期研究表明:MP的N端含有4个α-螺旋,使运动蛋白可以定位于核膜,C端富含精氨酸,有非特异的ssRNA结合活性。为了确定MP的关键功能域,设计引物分别扩增出MP,NMP（1-250 bp）,CMP（250-500 bp）构建含有CaMV的35S强启动子的植物表达载体。转化农杆菌后flowral-dip法转化拟南芥,筛选PCR鉴定后得到转基因系。统计植株的的生长发育情况后,发现转GFP:MP的植株开花时间推迟,平均比野生型晚10天,转CMP的植株次之。推测GFP:MP、CMP在植物体内影响了植物细胞周期相关基因,而CDC48在拟南芥芽、根、花的伸长细胞以及生长点细胞中均高度表达,荧光定量PCR结果显示CDC48到转基因植株中的表达水平降低。对CDC48拟南芥T-DNA插入突变体（cdc48）的生长实验表明:CDC48的抑制或下调表达导致拟南芥植株发育迟缓。这进一步暗示了MP可能通过抑制CDC48的表达影响植物的生长发育。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1. 大麦黄矮病毒概述
• 1.1 大麦黄矮病毒的形态、结构及分类
• 1.2 大麦黄矮病毒的基因组及产物的功能
• 1.3 大麦黄矮病毒运动蛋白的功能
• 1.4 大麦黄矮病毒运动蛋白的生物学功能
• 1.5 大麦黄矮病毒运动蛋白介导的抗病性
• 2. 植物的转基因技术
• 2.1 生物学方法
• 2.1.1 农杆菌介导法
• 2.1.2 花粉管通道法
• 2.1.3 子房注射法
• 2.2 物理法
• 2.2.1 基因枪法
• 2.2.2 超声波介导法
• 2.3 拟南芥的花序浸染法
• 3. 引言
• 第二章 原核表达载体构建及蛋白诱导表达
• 1. 材料
• 1.1 常规菌种
• 1.2 载体
• 1.3 试剂
• 1.4 常用培养基和溶液的配制
• 1.4.1 载体构建
• 1.4.2 蛋白诱导表达及检测
• 2. 方法
• 2.1 制备目的基因MP
• 2.1.1 BYDV-GAV-MP 基因的克隆
• 2.1.2 纯化，回收目的基因
• 2.1.3 限制性内切酶酶切目的基因及回收
• 2.2 制备质粒pET30a
• 2.2.1 限制性双酶切
• 2.2.2 电泳检测
• 2.2.3 异丙醇沉淀回收质粒片段
• 2.3 重组载体pET30a-MP 的构建
• 2.3.1 目的基因和载体连接
• 2.3.2 连接体系转化大肠杆菌 DH10B
• 2.3.3 菌落PCR 检测
• 2.3.4 鉴定重组质粒pET30a-MP
• 2.4 重组质粒 pET30a-MP 转化表达菌株 BL21（DE3）pLysS
• 2.4.1 制备BL21（DE3）pLysS 感受态细胞
• 2.4.2 质粒pET30a-MP 热激法转化BL21（DE3）pLysS
• 2.4.3 菌落PCR 检测
• 2.5 蛋白诱导表达
• 2.5.1 IPTG 诱导蛋白表达
• 2.5.2 SDS-PAGE
• 2.5.3 Western-blot
• 2.6 蛋白回收
• 3. 结果与分析
• 3.1 原核表达载体构建
• 3.2 MP 蛋白与组氨酸标签的融合表达
• 3.3 Western-blot
• 3.4 蛋白回收
• 4. 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第三章 酵母双杂交验证MP 二聚化
• 1. 材料
• 1.1 酵母菌株和载体
• 1.2 试剂
• 2. 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 目的基因制备
• 2.2.1 PCR 扩增目的基因
• 2.2.2 回收目的基因
• 2.2.3 限制性酶切目的基因
• 2.3 载体制备
• 2.3.1 质粒 pGADT7 转化大肠杆菌 DH10B
• 2.3.2 质粒提取pGADT7
• 2.3.3 酶切载体pGADT7
• 2.4 重组载体构建
• 2.4.1 连接
• 2.4.2 转化大肠杆菌 DH10B
• 2.4.3 菌落PCR
• 2.4.4 质粒PCR 和酶切检测
• 2.5 质粒自激活和毒性检测
• 2.5.1 酵母感受态细胞制备
• 2.5.2 PEG/LiAC 法转化酵母细胞
• 2.5.3 自激活和毒性检测
• 2.6 共转化酵母细胞AH109
• 2.6.1 质粒共转化酵母细胞
• 2.6.2 互作验证
• 3. 结果与分析
• 3.1 酵母穿梭载体构建
• 3.2 MP 自身互作的酵母双杂交验证
• 3.2.1 含BD 载体的毒性与自激活检测
• 3.2.2 含AD 载体的毒性和自激活检测
• 3.2.3 共转化酵母细胞
• 4. 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第四章 植物表达载体的构建
• 1. 材料
• 1.1 载体
• 1.2 试剂
• 2. 方法
• 2.1 中间载体pRNAi69 的构建
• 2.1.1 目的基因制备
• 2.1.2 pRNAi69 制备
• 2.1.3 重组载体构建（MP、NMP、CMP）
• 2.1.4 重组载体构建（pRNAi69-GFP:MP）
• 2.2 植物表达载体p27 的构建
• 2.2.1 目的片段制备
• 2.2.2 p27 制备
• 2.2.3 植物表达重组载体构建
• 2.3 转化农杆菌GV3101
• 2.3.1 制备农杆菌感受态细胞
• 2.3.2 冻融法转化农杆菌
• 2.3.3 菌落PCR 检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 中间载体pRNAi69 构建
• 3.2 植物表达载体构建
• 3.3 植物表达载体转化农杆菌
• 4. 小结与讨论
• 第五章 MP 转基因拟南芥植株的分子与生理学分析
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 拟南芥花序浸染Floral Dip 法转化拟南芥
• 2.1.1 拟南芥的种植
• 2.1.2 Floral dip 法转化拟南芥
• 2.2 转基因植株的筛选
• 2.3 转基因植株的鉴定
• 2.3.1 植物DNA 提取及PCR 鉴定
• 2.3.2 植物RNA 提取及PCR 鉴定
• 3. 结果与分析
• 3.1 转基因植株筛选
• 3.2 转基因植株鉴定
• 3.2.1 DNA 提取及PCR 检测
• 3.2.2 RNA 提取及RT-PCR
• 3.3 植株生长实验
• 3.3.1 转基因植株的生长差异
• 3.3.2 CDC48 突变体的生长差异
• 3.4 CDC48 在不同转基因系中的表达分析
• 4. 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 英文摘要