钠泵抑制介导的细胞死亡特征和机制研究

论文摘要

目的:本研究采用人脐静脉内皮细胞ECV304为靶细胞,观察钠泵抑制剂哇巴因（ouabain）对细胞死亡、细胞连接、细胞内游离Ca2+和活性氧自由基（ROS）的影响;检测哇巴因作用细胞前后钠泵α1亚单位、β1亚单位、VE-cadherin和Snail基因表达的改变,探讨钠泵抑制介导的细胞死亡特征和作用机制。方法:（1）MTT比色法检测哇巴因对细胞的生长抑制作用。（2）倒置光显微镜、透射电子显微镜观察细胞形态结构改变;Hoechst33342/PI双荧光染色,荧光显微镜观察细胞死亡特征,区分凋亡细胞与坏死细胞。（3）激光共聚焦显微镜观察血管内皮细胞内游离Ca2+、活性氧自由基。（4）琼脂糖凝胶电泳分析凋亡细胞DNA片段。（5）半定量RT-PCR法检测哇巴因对钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达以及VE-cadherin、Snail基因mRNA表达的影响。结果:（1）生长抑制作用:哇巴因可抑制ECV304细胞生长,且呈浓度-时间依赖性;高浓度哇巴因（10μmol/L）对细胞有剧烈抑制作用,而低浓度（0.001μmol/L）对细胞的增殖抑制作用有明显降低。经直线回归计算24 h、48 h、72 h IC50值分别为0.624、0.184、0.04μmol/L。（2）细胞形态学改变:ECV304为贴壁生长型细胞,哇巴因作用后细胞出现明显的形态学变化。5 10μmol/L的哇巴因作用细胞后,1224 h内引起细胞死亡,给予0.1μmol/L哇巴因干预2448 h,细胞变圆,细胞间缝隙增大,细胞折光性较差,随着作用时间的延长,细胞肿胀、破碎、死亡。而0.010.001μmol/L哇巴因处理后,与对照组相比无明显改变。电镜下可见凋亡细胞中,细胞器变性,染色质边集,沿核膜内缘呈团块状分布;同时可见胞浆空泡,胞质崩解等典型坏死细胞的特征;另外,哇巴因作用后细胞间连接消失。荧光显微镜下可见,10μmol/L哇巴因组细胞剧烈坏死成红色;0.1μmol/L哇巴因组细胞染色质浓缩呈亮珠状并形成凋亡小体等典型的凋亡形态学改变。（3）琼脂糖凝胶电泳结果:0.1μmol/L的哇巴因处理ECV304细胞48、60 h,从中提取的DNA电泳,0.1μmol/ L哇巴因作用48 h后,DNA琼脂糖凝胶电泳显示较典型的DNA ladder带;随着作用时间的延长,死亡细胞增多,60 h后出现smear条带。（4）哇巴因作用后细胞内Ca2+浓度、氧自由基含量升高,且二者均呈浓度-时间依赖性。（5）哇巴因对钠泵α1和β1亚单位mRNA表达的影响:哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位的表达,下调β1亚单位表达,且两者均呈浓度-时间依赖性。与对照组比较,随着哇巴因浓度的增加、作用时间的延长,钠泵α1亚单位mRNA表达明显升高;相反,β1亚单位mRNA表达降低。（6）哇巴因对VE-cadherin和Snail基因mRNA表达的影响:RT-RCR结果显示:哇巴因能浓度-时间依赖性下调VE-cadherin表达、上调Snail表达。随着哇巴因作用浓度的增加和作用时间的延长,VE-cadherin基因mRNA表达逐渐下降,相反Snail基因mRNA表达逐渐升高,且二者的表达存在逆反关系,Snail在转录水平抑制VE-caadherin的表达。结论:（1）哇巴因可明显抑制ECV304细胞的生长,抑制作用呈现浓度-时间依赖性。（2）不同浓度哇巴因对血管内皮细胞的作用不同:高浓度可短时间引起细胞坏死,而低浓度可诱导细胞凋亡。（3）哇巴因作用后细胞内Ca2+浓度增加、氧自由基含量升高。（4）哇巴因能浓度-时间依赖性上调钠泵α1亚单位和Snail基因的表达、下调β1亚单位和VE-cadherin基因表达;β1亚单位和VE-cadherin表达共同降低,同时Snail抑制VE-cadherin的表达,从而使细胞间黏附降低,细胞间连接丧失,细胞脱落死亡。由此推测,哇巴因对血管内皮细胞的作用与钠泵亚单位介导信号传递,降低细胞黏附有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文钠泵抑制介导的细胞死亡特征和机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 钠泵抑制对细胞存活的影响研究进展
• 致谢
• 个人简历