聚乙二醇单修饰重组水蛭素的研究

论文摘要

水蛭素是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂，但由于其血浆半衰期很短，严重限制了其在临床上的抗凝应用。聚乙二醇（PEG）修饰是常用的提高蛋白和多肽类药物血浆半衰期的方法，已有多种PEG修饰的蛋白类药物上市，如PEG-Intron?（PEGinterferonα-2b），PEGasys?（PEGinterferonα-2a），Neulasta?（pegfilgrastim，PEG G-CSF）等，通过修饰这些药物的体内循环半衰期和生物利用度均有所增加。关于水蛭素的聚乙二醇修饰，国内外也已开展了很多工作，但所用修饰方法多为碱性条件下修饰水蛭素的赖氨酸残基，这将不可避免的导致修饰水蛭素的活性中心（Lys47）的修饰，且修饰反应产物是复杂的混合物（四修饰、三修饰、二修饰和单修饰产物的混合物）。为了避免水蛭素活性中心的修饰、得到均一的单修饰产物，本文应用了两种修饰策略来制备聚乙二醇单修饰重组水蛭素。首先，采用微酸性修饰策略，选择性的修饰重组水蛭素唯一的组氨酸残基以得到单修饰产物。在pH 6.0条件下把单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯（Succinimidylcarbonyl mPEG，SC-mPEG，20kDa）与重组水蛭素偶联，反应混合物经一步阴离子交换色谱（IEC）分离纯化得到单修饰产物，单修饰产物占修饰产物的94.6％。通过中性羟胺法处理，发现单修饰产物中79.71％为组氨酸修饰位置异构体，表明该修饰策略大体上避开了重组水蛭素活性中心（Lys47）的修饰。单修饰产物的纯度大于95％，其体外抗凝活性保留率为34％。另外，本文利用阴离子交换介质辅助重组水蛭素的PEG修饰，以得到单修饰产物。在pH 6.0，20mM PBS，r-Hir∶SC-mPEG=1∶3的条件下，修饰反应和分离纯化在阴离子交换介质上偶联以直接得到单修饰产物。电泳检测修饰产物为单修饰产物，通过中性羟胺法处理单修饰产物，发现在该微酸性条件下，修饰未发生在组氨酸残基，根据修饰反应理论推断修饰位点为N-末端氨基。单修饰产物的纯度大于95％，单修饰产物的体外抗凝活性保留率为34.85％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 水蛭素及其药理作用、药代动力学
• 1.1.1 水蛭素结构及其理化性质
• 1.1.2 水蛭素的药理作用
• 1.1.3 水蛭素的药代动力学
• 1.2 蛋白类药物的聚乙二醇修饰
• 1.2.1 PEG的特性
• 1.2.2 第一代PEG化化学
• 1.2.3 第二代PEG化化学
• 1.2.4 聚乙二醇修饰水蛭素的研究现状
• 1.3 聚乙二醇化蛋白质的分离纯化
• 1.3.1 基于分子量差异的分离纯化
• 1.3.2 基于电荷差异的分离
• 1.3.3 其他分离纯化方法
• 1.4 聚乙二醇化蛋白质的检测与分析
• 1.4.1 色谱法
• 1.4.2 SDS-PAGE法
• 1.4.3 分光光度法
• 1.4.4 凝胶渗透色谱法
• 1.4.5 其他方法
• 1.5 水蛭素的体外抗凝活性的检测方法
• 1.5.1 凝血酶直接滴定法
• 1.5.2 Chromonym TH为生色底物的比色法
• 1.5.3 光散射法
• 1.5.4 凝血酶滴定法的改进
• 参考文献
• 2 聚乙二醇单修饰水蛭素分离纯化方法研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 单修饰产物的分离纯化方法（SEC-IEC）
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 单修饰产物的分离纯化方法
• 2.5 小结
• 参考文献
• 3 微酸性条件下聚乙二醇化水蛭素的制备、检测分析及其体外活性测定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 单修饰水蛭素的制备
• 3.3.2 单修饰水蛭素的分析检测
• 3.3.3 单修饰水蛭素的体外抗凝活性检测
• 3.3.4 组氨酸修饰产物含量检测
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 修饰反应pH对于单修饰产物产量的影响
• 3.4.2 单修饰产物的分离纯化以及分析检测
• 3.4.3 单修饰r-Hirudin的体外抗凝活性测定
• 3.4.4 His-修饰位置异构体含量测定
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 参考文献
• 4 固相介质辅助的聚乙二醇化重组水蛭素的制备、检测分析及其体外活性测定
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 固相修饰反应的条件优化
• 4.3.2 固相修饰反应混合物的分离纯化
• 4.3.3 蛋白浓度的测定
• 4.3.4 SDS-PAGE电泳检测
• 4.3.5 固相辅助单修饰产物的修饰位点检测
• 4.3.6 凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 固相修饰反应的条件优化
• 4.4.2 固相修饰反应混合物的分离纯化
• 4.4.3 固相辅助单修饰产物的纯度及修饰位点检测
• 4.4.4 凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性
• 4.5 结论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢