论文摘要
环境友好高效的生物冶金技术的工业应用和发展亟需理论的突破以给生产实践提供指导,但由于对生物因素了解的局限性及生物冶金体系本身的复杂性一直妨碍了人们对生物冶金体系的全局的理解。本论文运用序列比对与识别、同源模建、进化踪迹分析、途径网络重构、分子模拟、量子化学计算、静电势分析、分子对接等生物信息学和分子计算方法,结合蛋白质表达纯化和定点突变与表征等技术,对嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans,简称A.f菌）在浸矿过程中利用铁硫能源驱动生物体合成的铁硫代谢能量传递过程进行了系统地研究,构建了其能量传递途径网络图,解释了单个A.f菌如何浸矿。此外,对硫化矿生物浸出体系及其能量传递耦合的产酸问题进行了分析。论文的具体研究内容和结果可概括为五个方面:一.A.f菌的若干能量传递蛋白的结构分析与反应机理预测。细胞色素c:A.f菌有10个细胞色素c,聚类分析表明它们分成4大同源蛋白类。其中4个周质细胞色素c4家族蛋白的序列结构比较表明位于Cyc1的Tyr63和Glu121位点附近的残基差异决定它们的功能差异。细胞色素bc1复合体:A.f菌有2个细胞色素bc1复合体,对它们进行了结构模建和机理探讨,序列和结构比较显示了它们在细胞色素b亚基位于血红素bL辅基近溶液外侧的Arg79位点存在差异,这可能导致了它们的正反向功能差异。终端氧化酶:A.f菌有4个终端氧化酶,对它们进行了结构模建和机理探讨,结果表明,细胞色素aa3和ba3复合体的电子供体是周质细胞色素c;细胞色素bo3和bd复合体的电子供体是泛醌。细胞色素CycA1:模建了三维分子结构,它包含2个血红素辅基。细胞色素Cyc2like蛋白:生物信息学分析表明它是定位于外膜含一个血红素的高分子量细胞色素蛋白。硫化物泛醌还原酶（SQR）:SQR的结构尚未解析,模建了A.f菌源SQR三维分子结构,并跟黄素（FAD）和泛醌（UQ）进行分子对接,根据这些结果提出了其反应机理。基因doxDA:A.f菌doxDA-1与doxDA-2基因的生物信息学分析表明它们是融合基因。DsbG蛋白:结构模建结果表明,二聚体DsbG蛋白中的两个单体对称结合,2个保守的Cys119和Cys122残基的位置远离二聚体DsbG蛋白的接触面,但它们的位置十分接近。核糖-5-磷酸异构酶:模建了三维分子结构并跟底物R5P进行了分子对接,根据对接结果识别了催化的关键残基,提出了其反应机理。谷胱甘肽还原酶:模建了三维分子结构并跟底物进行分子对接,根据对接结果识别了催化的关键残基,提出了其反应机理。二.A.f菌的若干能量传递蛋白的结构模建与表达验证。铜蓝蛋白:静电势分析、活性位点量化计算和蛋白质表达定点突变实验证实残基Cys138对结合铜原子非常重要。亚铁氧化酶（Iro）:Iro的结构尚未解析,模建了A.f菌源Iro结构,结果表明它是由4个半胱氨酸配位[Fe4S4]铁硫簇的高电位铁硫蛋白（HiPIP）家族蛋白,对离铁硫簇十分近的Tyr10虚拟突变实验预测了该位置处的芳香环对保护铁硫簇起重大作用,蛋白质的表达纯化及定点突变实验进一步证实了这些结论。高电位铁硫蛋白:结构模建表明它含有4个半胱氨酸配位的[Fe4S4]铁硫簇;蛋白的表达纯化实验表明它含有铁硫簇活性中心;定点突变实验进一步证实预测的残基配位[Fe4S4]铁硫簇。亚硫酸还原酶:模建了它的黄素蛋白（SiR-FP）和血红素蛋白（SiR-HP）的三维分子结构,结果表明,SiR-HP中4个保守的Cys427,Cys433,Cys472和Cys476残基配位位于单体结构的中心的[Fe4S4]铁硫簇,血红素位于铁硫簇附近。蛋白的表达纯化实验表明SiR-FP含有[Fe4S4]铁硫簇活性中心和血红素基团,定点突变实验证实预测的残基配位[Fe4S4]铁硫簇。APS还原酶:结构模建结果表明它含有由4个保守的Cys110,Cys111,Cys193和Cys196残基配位[Fe4S4]铁硫簇,底物APS分子对接的结果显示其位置就在附近。蛋白的表达纯化实验表明它含有铁硫簇活性中心。铁硫簇组装供硫蛋白（IscS）:模建了A.f菌源IscS的完整的三维分子结构,跟辅因子PLP和底物半胱氨酸分子对接发现了一些重要残基;蛋白的表达纯化实验进一步证勃A.f菌源的IscS是一个半胱氨酸脱硫酶,它依赖PLP,催化L型半胱氨酸转变成L型丙氨酸和硫烷硫,为铁硫簇组装供硫。铁硫簇组装蛋白（IscA）:IscA可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]铁硫簇,结构模建和蛋白的定点突变实验验证表明A.f菌源IscA含有由Cys35,Cys99,Cys101和Glu103配位的[Fe4S4]铁硫簇。铁硫簇支架蛋白（IscU）:IscU可能含[Fe4S4]或[Fe2S2]铁硫簇,结构模建和蛋白的定点突变实验验证表明A.f菌源IscU含有由Cys37,Cys63,Cys106和Asp39配位的[Fe2S2]铁硫簇。铁氧还蛋白:铁氧还蛋白可能含[Fe4S4],[Fe3S4]或[Fe2S2]铁硫簇,结构模建表明它是由4个半胱氨酸残基Cys42,Cys48,Cys51和Cys87配位[Fe2S2]的铁硫蛋白;蛋白的表达纯化实验表明A.f菌源的铁氧还蛋白正确插入[Fe2S2]铁硫簇;定点突变实验进一步证实预测的残基配位[Fe2S2]铁硫簇。超氧化物歧化酶:进行了三维结构模建和进化踪迹分析,它的活性中心由Cys35,Cys99,Cys101和Glu103配位铁原子组成;蛋白的表达纯化实验表明它是含铁超氧化物歧化酶。中链乙酰辅酶A脱氢酶:它及其Y375K突变体与乙酰辅酶A的分子对接比较研究和蛋白表达验证结果表明,中链乙酰辅酶A脱氢酶的Tyr375突变成Lys375使其获得了乙酰辅酶A氧化酶活性。乙酰辅酶A氧化酶:分子对接预测和蛋白的表达验证结果表明Oct-2-en-4-ynoyl-CoA是它的一个特异性抑制剂。三.A.f菌的若干多拷贝能量传递蛋白的分子多样性。在三维分子结构层次考察了A.f菌的细胞色素c4类蛋白、铜蓝蛋白、高氧还电位铁硫蛋白、硫化物泛醌还原酶在不同菌株和相同菌株的不同拷贝间的分子多样性。结果表明相同菌株的不同拷贝蛋白间的差异处于分子的局部;不同菌株同一蛋白间的差异为数个远离活性中心的残基,但有少数在活性中心附近发生突变。四.A.f菌浸矿过程铁硫代谢的能量传递网络图。对A.f ATCC 23270全基因组涉及铁硫代谢能量传递的二百多个基因和三十多个多基因操纵子进行了系统地分析,结合前面各部分的研究结果和已有文献的研究成果,构建了A.f菌浸矿过程铁硫代谢能量传递网络图。它包括矿物的分解,溶液中的反应,A.f菌的呼吸链、亚铁氧化、硫代谢、二氧化碳固定、氮气固定及氢气利用等部分。图中对所涉及蛋白的同工酶和多拷贝蛋白的个数及一些重要反应的氧还电势也进行了标注。通过这个图,可明白单A.f菌如何浸矿。五.硫化矿生物浸出体系的分析及产酸问题。以生成新物质的流量为切入点,系统地分析了硫化矿生物浸出体系,该体系的变化主要由铁硫碳氮氧和金属六条关键物质流主导。最后,根据A.f菌浸矿过程铁硫代谢能量传递网络图结果对硫化矿生物浸出过程能量传递耦合的产酸问题进行了分析。
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论文课题来源摘要ABSTRACT符号说明第一章 绪论1.1 微生物冶金的发展与应用1.1.1 微生物冶金的定义和优点1.1.2 微生物冶金的历史1.1.3 微生物冶金的现状1.1.4 微生物冶金的反应机理1.1.5 冶金微生物的研究现状1.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的研究现状1.2.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的应用1.2.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化系统1.2.3 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫氧化系统1.3 生物信息学概述1.4 蛋白质结构预测1.5 本论文的研究目的和意义1.6 本论文的研究内容第二章 研究理论与方法2.1 生物信息学2.1.1 序列比对2.1.2 序列数据库搜索2.2 量子化学从头算方法2.2.1 量子化学从头算和Hartree-Fock理论2.2.2 密度泛函理论2.2.3 势能面及几何构型优化2.3 分子力学2.3.1 Born-Oppenheimer近似2.3.2 力场的组成和定义2.3.3 能量表示2.3.4 力场参数化2.3.5 分子力学2.3.6 优化的概念2.3.7 优化算法2.3.8 优化中要注意的几点2.4 分子动力学模拟2.4.1 积分算法2.4.2 微正则系综的分子动力学2.4.3 正则系综的分子动力学2.4.4 等温等压系综的分子动力学2.5 同源模建2.6 分子对接2.7 进化踪迹分析2.8 蛋白质表达纯化与定点突变2.8.1 实验材料2.8.2 实验方法2.8.3 定点突变2.8.4 测试分析方法2.9 使用的软件工具和生物学数据库2.10 总体研究方案2.11 本章小结第三章 电子载体的结构模建与比较及能量传递的框架模型3.1 引言3.2 能量传递相关基因和操纵子的分析3.3 十个细胞色素c分为四个同源蛋白类3.3.1 细胞色素c的聚类分析3.3.2 Glu121位点和Tyr63位点差异区分细胞色素c4类蛋白功能1复合体细胞色素c亚基的比较'>3.3.3 细胞色素bc1复合体细胞色素c亚基的比较3.3.4 外膜高分子量细胞色素c的比较3.3.5 小分子量细胞色素c的比较1复合体的结构模建和比较及机理探讨'>3.4 两个细胞色素bc1复合体的结构模建和比较及机理探讨1复合体的序列比对'>3.4.1 细胞色素bc1复合体的序列比对1复合体的分子结构模建'>3.4.2 细胞色素bc1复合体的分子结构模建1复合体的正反向功能'>3.4.3 b亚基Arg79位点的差异区分两个bc1复合体的正反向功能1复合体的作用机理探讨'>3.4.4 反向细胞色素bc1复合体的作用机理探讨3.5 终端氧化酶的结构模建和机理探讨及比较3复合体的电子供体为周质细胞色素c'>3.5.1 细胞色素aa3复合体的电子供体为周质细胞色素c3复合体的电子供体为泛醌'>3.5.2 细胞色素bo3复合体的电子供体为泛醌3和bo3复合体的比较'>3.5.3 细胞色素aa3和bo3复合体的比较3复合体的电子供体为周质细胞色素c'>3.5.4 细胞色素ba3复合体的电子供体为周质细胞色素c3.5.5 细胞色素bd复合体的电子供体为泛醌3.5.6 终端氧化酶的比较3.6 NADH-Q还原酶的正反向作用机理探讨3.7 A.f菌能量传递的框架模型3.8 本章小结第四章 铁氧化相关蛋白的结构模建及表达和定点突变4.1 引言4.2 铁代谢相关基因及操纵子分析4.3 铜蓝蛋白的Cys138是绑定Cu的重要残基4.3.1 铜蓝蛋白的静电势分析与量化计算4.3.2 铜蓝蛋白的表达与纯化4.3.3 铜蓝蛋白的分析4.3.4 铜蓝蛋白的讨论4.4 亚铁氧化酶是含[4Fe4S]簇的高电位铁硫蛋白4.4.1 亚铁氧化酶的序列同源比对4.4.2 亚铁氧化酶的三维分子结构预测4.4.3 亚铁氧化酶Tyr10位点的虚拟突变4.4.4 亚铁氧化酶及其突变体的表达与纯化4.4.5 Iro蛋白的讨论4.5 高电位铁硫蛋白（HiPIP）的结构模建及表达纯化和定点突变4.5.1 高氧还电位铁硫蛋白的序列同源比对4.5.2 高氧还电位铁硫蛋白的三维分子结构预测4.5.3 高氧还电位铁硫蛋白及其突变体的表达与纯化4.5.4 HiPIP蛋白的讨论4.6 细胞色素CycA1是周质双血红素蛋白4.6.1 细胞色素CycA1的序列同源比对4.6.2 细胞色素CycA1的三维分子结构预测like是外膜单血红素辅基蛋白'>4.7 细胞色素Cyc2like是外膜单血红素辅基蛋白4.8 铁氧化的细节作用图4.9 本章小结第五章 硫代谢相关蛋白的结构模建和分子对接及其代谢网络5.1 引言5.2 硫代谢相关基因及操纵子分析5.3 硫化物泛醌还原酶的结构模建和分子对接5.3.1 三维结构预测5.3.2 绑定位点识别5.3.3 跟黄素（FAD）的分子对接5.3.4 跟辅酶Q的分子对接5.3.5 催化机理分析5.4 硫代硫酸盐泛醌氧化还原酶（TQO）的生物信息学分析5.4.1 doxDA-1与doxDA-2是融合基因5.4.2 doxDA-1与doxDA-2的同源序列分析5.5 亚硫酸还原酶的结构模建及表达纯化和定点突变5.5.1 SiR-HP的序列同源比对5.5.2 SiR-HP的三维分子结构预测5.5.3 SiR-HP蛋白及其突变体的表达与纯化5.5.4 SiR-FP的三维分子结构预测及分子对接5.6 APS还原酶的结构模建和底物对接及表达纯化5.6.1 APS还原酶的序列同源比对5.6.2 APS还原酶的三维分子结构预测5.6.3 APS还原酶蛋白表达与纯化5.7 DsbG蛋白的结构模建5.8 谷胱甘肽（GSH）跨内膜的依据5.9 元素硫的转运探讨5.10 硫代谢总体模型5.11 本章小结第六章 二氧化碳固定的代谢网络的重构6.1 引言6.2 二氧化碳相关基因的识别及其冗余分析6.3 核糖-5-磷酸异构酶（RptA）的结构模建及分子对接6.3.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的RpiA的结构模建6.3.2 识别R5P的绑定区域6.3.3 afRpiA和R5P的相互作用6.3.4 结论6.4 二氧化碳固定的途径网络图重构6.5 本章小结第七章 氮气固定和氢气利用的代谢网络重构7.1 引言7.2 固氮系统相关基因和操纵子的识别及分析7.3 氢气利用系统相关基因和操纵子的分析7.4 氮气固定和氢气利用的代谢网络模型7.5 本章小结第八章 铁硫簇组装相关蛋白的结构模建和表达8.1 引言8.2 铁硫簇组装（Isc）操纵子分析8.3 铁硫簇组装供硫酶（IsoS）的结构模建和分子对接及表达8.3.1 IscS的结构模建8.3.2 识别PLP和半胱氨酸的绑定区域8.3.3 afIscS和PLP的相互作用8.3.4 全酶afIscS和底物半胱氨酸的相互作用8.3.5 IscS蛋白的表达与纯化8.4 铁硫簇组装蛋白IscA的结构模建及表达8.4.1 IscA的序列同源比对8.4.2 IscA的三维分子结构预测8.4.3 IscA蛋白及其突变体的表达与纯化8.4.4 IscA蛋白的讨论8.5 铁硫簇组装支架蛋白（IscU）的结构模建及表达纯化8.5.1 IscU的的序列同源比对8.5.2 IscU的的三维分子结构预测8.5.3 IscU蛋白及其突变体的表达与纯化8.5.4 IscU蛋白的讨论8.6 铁氧还蛋白的结构模建及表达纯化8.6.1 铁氧还蛋白的序列同源比对8.6.2 铁氧还蛋白的三维分子结构预测8.6.3 铁氧还蛋白及其突变体的表达与纯化8.6.4 铁氧还蛋白的讨论8.7 铁硫簇的组装流程模型8.8 本章小结第九章 抗毒性相关蛋白的结构模建和表达9.1 引言9.2 超氧化物歧化酶（SOD）的结构模建和进化踪迹分析及表达9.2.1 超氧化物歧化酶的结构模建9.2.2 进化踪迹分析9.2.3 表达纯化与表征9.2.4 结论9.3 谷胱苷肽还原酶的结构模建和分子对接9.3.1 谷胱甘肽还原酶的结构模建9.3.2 识别FAD和GSSG的绑定区域9.3.3 谷胱甘肽还原酶和底物的相互作用9.4 中链乙酰辅酶A脱氢酶的Y375K产生乙酰辅酶A氧化酶活性9.4.1 MCAD的Y375K后与乙酰辅酶A的分子对接9.4.2 实验验证9.5 Oct-2-en-4-ynoyl-CoA是乙酰辅酶A氧化酶的特异性抑制剂9.5.1 乙酰辅酶A氧化酶与Oct-2-en-4-ynoyl-CoA的分子对接9.5.2 实验验证9.6 本章小结第十章 A.f菌的若干多拷贝能量传递蛋白的分子多样性10.1 引言4的多样性'>10.2 细胞色素c4的多样性4蛋白的同源序列比对'>10.2.1 细胞色素c4蛋白的同源序列比对4蛋白的系统发育分析'>10.2.2 细胞色素c4蛋白的系统发育分析4蛋白的多样性分析'>10.2.3 基于三维分子结构的细胞色素c4蛋白的多样性分析10.3 铜蓝蛋白（Rusticyain）的多样性10.3.1 铜蓝蛋白的同源序列比对10.3.2 铜蓝蛋白的系统发育分析10.3.3 基于三维分子结构的铜蓝蛋白的多样性分析10.4 亚铁氧化酶和高电位铁硫蛋白的比较及多样性10.4.1 Iro和HiPIP的序列同源比较10.4.2 Iro和HiPIP的系统发育分析10.4.3 基于三维分子结构的Iro和HiPIP的多样性分析10.5 硫化物泛醌还原酶（SQR）的多样性分析10.5.1 硫化物泛醌还原酶的同源序列比对10.5.2 SQR的系统发育分析10.5.3 基于三维分子结构的SQR的多样性分析10.6 16S RNA的多样性分析10.7 gyrB的多样性分析10.8 总体多样性讨论10.9 本章小结第十一章 A.f菌浸矿过程铁硫代谢能量传递及其产酸分析11.1 引言11.2 A.f菌浸矿过程铁硫代谢能量传递网络图的构建11.3 硫化矿生物浸出的输入输出黑箱模型11.4 硫化矿生物浸出体系的物质流量分析11.5 能量传递体系的耦合分析11.6 硫化矿生物浸出的产酸分析及解决办法11.7 本章小结第十二章 总结12.1 总结12.2 工作展望参考文献致谢攻读博士学位期间主要的研究成果一.论文发表二.攻读学位期间主要的研究成果及奖励
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