米曲霉高活性蛋白酶菌株选育及酱油多菌种混合酵条件的研究

论文摘要

酱油是我国传统的调味品,因其独特的风味,丰富的营养物质,现已成为人们生活中必需的调味品之一。虽然我国酱油总产量已经位居世界首位,但是酱油产品的质量较低。在国际市场上,高品质的酱油绝大多数来自日本和韩国等国家。这主要是因为我国酿造企业设备比较陈旧,生产技术比较落后,造成原料利用率低,酱油产品质量不高。因此,运用现代生物发酵技术,通过现代高科技设备仪器,对多菌种混合发酵工艺进行研究,以提高原料的利用率,改善酱油的风味物质,提高酱油质量,使生产成本下降以及生产技术水平能够得到较大提高,进而增加我国酱油在国际市场上竞争力。本文采用原生质体紫外诱变的方法对出发菌株米曲霉沪酿3.043菌株进行诱变,经过初筛、复筛,最终选育出一株高活性蛋白酶突变菌株米曲霉TZ-04。经过遗传稳定性实验,其中性蛋白酶活力稳定在1700U/g以上,约是出发菌株的1.8倍。然后通过单因素试验和响应面优化法对得到的米曲霉TZ-04菌株进行产酶条件的优化,利用SAS软件进行分析,得到最优化产酶条件为：物料比（豆粕：麸皮）为6：4润水量为1：1、蒸煮时间为30min、自然PH、培养温度为28℃、培养时间为66h时,其中性蛋白酶活力达到最高。通过发酵试验,米曲霉TZ-04产中性蛋白酶活力试验值与预测值接近,优化后其所产蛋白酶活力比原始条件下提高了20.8%。以氨基态氮、总酸和全氮量为响应值,采取多菌种分开制曲,利用多菌种多酶系特点,采取不同比例混合发酵,通过小试试验得到四种霉菌大曲的最佳混合发酵的比例和发酵中期生香酵母的添加量。试验的结果为：米曲霉TZ-04：黑曲霉3.350：米根酶：红曲霉大曲的最佳混合比例为7：1：1：1,按此比例发酵产物中氨基态氮、总酸和全氮量均最高,发酵中期生香酵母添加量为2%。中试试验采用真空负压接种,多菌种分开制曲方法,进行混合发酵,发酵中期加入生香酵母以增加酱油中的酯、醇类物质,改善酱油的风味。用此工艺发酵的酱油氨基态氮含量为1.37g/100ml、总酸含量为3.15 g/100ml、全氮的含量为2.15g/100ml、还原糖的含量为1.41 g/100ml、总酯的含量为145.7 mg/ml、色率为56823EBC以及红指为2.88,与工厂使用的沪酿3.042和黑曲霉3.350双菌种混合发酵工艺相比,分别提高了28%、39.4%、18.8%、25.9%、22.2%、48.5%、36.5%；而且多菌种混合发酵全氮利用率达到了87.3%,比对照组提高了12%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 酱油的发展历史及现状
• 1.1.1 酱油的发展历史
• 1.1.2 酱油的发展现状
• 1.2 选题的目的与意义
• 1.2.1 选题目的
• 1.2.2 选题意义
• 1.3 酱油的生产工艺
• 1.3.1 低盐固态发酵
• 1.3.2 高盐稀态发酵
• 1.3.3 分酿固稀发酵
• 1.3.4 其他发酵工艺
• 1.4 酱油生产的原料
• 1.4.1 蛋白质原料
• 1.4.2 淀粉质原料
• 1.4.3 食盐
• 1.4.4 水
• 1.5 酱油生产菌株
• 1.5.1 米曲霉
• 1.5.2 黑曲霉
• 1.5.3 米根霉
• 1.5.4 红曲霉
• 1.5.5 酵母菌
• 1.6 菌种选育的方法
• 1.6.1 自然选育
• 1.6.2 诱变育种
• 1.6.3 原生质体融合技术
• 1.6.4 DNA重组技术
• 1.7 国内外研究进展
• 1.8 本课题的研究内容
• 第2章 米曲霉高活性蛋白酶菌株的选育
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌丝体的培养
• 2.2.2 原生质体制备
• 2.2.3 紫外诱变
• 2.2.4 紫外诱变初筛
• 2.2.5 紫外诱变复筛
• 2.2.6 遗传稳定性测定
• 2.2.7 蛋白酶活力的测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 酪氨酸标准曲线
• 2.3.2 酶解时间的确定
• 2.3.3 原生质体制备效果
• 2.3.4 诱变时间与致死率的关系
• 2.3.5 诱变后菌株的筛选结果
• 2.3.6 诱变菌株蛋白酶活力
• 2.3.7 遗传稳定性试验结果
• 2.4 小结
• 第3章 米曲霉TZ-04产酶条件的研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂与仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 米曲霉TZ-04的培养
• 3.2.2 单因素试验
• 3.2.3 响应面试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 单因素试验结果分析
• 3.3.1.1 原料配比对米曲酶ZT-04产酶的影响
• 3.3.1.2 培养温度对米曲霉ZT-04产酶的影响
• 3.3.1.3 初始润水量对米曲霉ZT-04产酶的影响
• 3.3.1.4 初始pH对米曲霉ZT-04产酶的影响
• 3.3.1.5 培养时间对米曲酶TZ-04产酶的影响
• 3.3.1.6 蒸煮时间对米曲霉ZT-04产酶的影响
• 3.3.2 响应面试验结果分析
• 3.3.2.1 因素水平表设计及Plackett-Burman试验结果
• 3.3.2.2 最陡爬坡试验
• 3.3.2.3 响应面试验
• 3.3.2.4 验证性试验
• 3.4 小结
• 第4章 酱油多菌种混合发酵条件试验的研究
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂与仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 酱油多菌种分开制曲工艺
• 4.2.2 酱油多菌种混合发酵工艺
• 4.2.3 大曲各项理化指标测定
• 4.2.3.1 蛋白酶活力测定
• 4.2.3.2 糖化酶活力测定
• 4.2.3.3 淀粉酶活力的测定
• 4.2.3.4 水分的测定
• 4.2.3.5 孢子数的测定
• 4.2.4 酱油各项指标的测定
• 4.2.4.1 酱油发酵液氨基态氮含量测定
• 4.2.4.2 酱油发酵液总酸含量测定
• 4.2.4.3 酱油发酵液全氮含量测定
• 4.2.4.4 酱油发酵液总酯含量的测定
• 4.2.4.5 酱油发酵液色率、红色指数、黄色指数含量测定
• 4.2.4.6 酱油发酵液可溶性无盐固形物含量测定
• 4.2.4.7 酱油发酵液pH值测定
• 4.2.4.8 还原糖测定
• 4.2.4.9 全氮利用率计算
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 多菌种分别制曲条件的确定
• 4.3.1.1 菌种选择依据
• 4.3.1.2 不同比例大曲混合发酵对氨基态氮、总酸、全氮的影响
• 4.3.1.3 生香酵母添加比例
• 4.3.2 中试试验
• 4.3.2.1 种曲扩大培养结果
• 4.3.2.2 大曲培养结果
• 4.3.2.3 大曲各项理化指标测定结果
• 4.3.2.4 其他大曲中水分的测定结果
• 4.3.2.5 多菌种混合发酵
• 4.3.2.6 发酵过程氨基态氮变化
• 4.3.2.7 发酵过程总酸变化
• 4.3.2.8 发酵过程全氮变化
• 4.3.2.9 发酵过程还原糖变化
• 4.3.2.10 酱油原油中其它各项理化指标含量测定
• 4.4 小结
• 第5章 结论
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文及获奖情况
• 致谢