核仁磷酸蛋白突变对白血病细胞生物学特性的影响及机制初探

论文摘要

急性髓系白血病（acute myeloblastic leukemia,AML）是一类造血系统恶性肿瘤,其发病急骤,病程短,死亡率较高。传统的放化疗治疗AML完全缓解率较低,易复发。虽然造血干细胞移植是根治AML的方法,但是存在着排异反应、治疗费用昂贵等诸多问题。近年来不断发现白血病发病过程相关的多种融合基因,这些基因在病程中比较稳定,与白血病的发病及病程进展有关,具有重要的临床意义。然而,白血病具有高度异质性,各型白血病相关基因种类繁多,目前尚未发现与各型别AML发病都密切相关的一个特异性基因。最近研究发现,在AML患者中频繁发生核仁磷酸蛋白（nucleophosmin,NPM）基因突变,它可见于除M3型外的各型AML中。临床资料显示,在成人和儿童AML患者中,NPM突变均有发生,其发生率随着年龄的增长而增加。进一步研究发现,NPM突变通常累及白血病干/祖细胞,并且受累的白血病细胞常不伴有已知AML相关融合基因的异常,提示NPM突变可能在AML发生的早期阶段发挥作用。临床研究发现,NPM突变与患者的预后密切相关,不仅可以指导治疗措施的选择和制定,而且还可以作为监测微量残留病的新指标。因此,有学者建议将NPM突变指标纳入临床AML的WHO分型标准中,这进一步证实了NPM突变在临床上AML的发生发展以及转归中的重要作用。最近发现,NPM突变能够促进正常小鼠成纤维细胞NIH3T3恶性转化,但是其对白血病细胞生物学特性的影响还未见文献报道。因此,NPM突变对白血病细胞生物学特性的影响及作用的分子机制有待阐明。本课题采用基因转染技术,以NPM无突变的CD34+白血病细胞系KG-1a为研究对象,分析突变型NPM对早期白血病细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。主要的结果和结论如下:1.检测KG-1a细胞中CD34抗原和突变型NPM基因的表达。首先利用流式细胞仪（FACS）检测KG-1a细胞中CD34+细胞含量,发现KG-1a细胞系中CD34+细胞比例占96.3%。然后利用RT-PCR和免疫组化分别检测突变型NPM基因表达及其蛋白的亚细胞分布,证实了KG-1a细胞是高表达CD34的早期白血病细胞,不表达突变型NPM基因和蛋白,符合后续实验的要求。2.转染突变型NPM基因,观察其对白血病细胞增殖和凋亡的影响。首先在通过脂质体介导下将突变型NPM基因转染入KG-1a细胞并筛选稳定表达株。RT-PCR和免疫组化检测突变NPM基因和蛋白表达情况,证明转染后白血病细胞表达突变型NPM基因和蛋白;其次采用FACS检测细胞周期,发现转染组细胞周期进程明显增快,同时台盼蓝染色计数活细胞,显示细胞增殖能力增强;最后采用分光光度方法检测细胞casepase-3的活性以判断细胞凋亡情况,结果显示转染组细胞casepase-3的活性下降,细胞凋亡减少。上述实验表明了突变型NPM不仅能够促进细胞周期进程,促进细胞体外增殖,而且还赋予细胞抗凋亡的性质。3.初步探讨突变型NPM影响白血病细胞生物学特性的分子机制。首先利用RT-PCR检测细胞周期调节因子p21 mRNA水平,发现转染组细胞p21的mRNA表达减低;然后检测细胞casepase-9的活性,发现转染组细胞casepase-9活性明显降低。证实了转染突变型NPM可以下调p21的表达,促进细胞周期进程,导致细胞过度增殖;同时还通过下调线粒体凋亡途径中重要的调节因子casepase-9的活性,从而引起凋亡效应分子casepase-3活性的降低,导致细胞抵抗凋亡。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 白血病细胞突变型NPM 基因和蛋白的表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 转染突变型NPM 基因对白血病细胞生物学特性的影响..
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 突变NPM 影响白血病细胞生物学特性的分子机制初探..
• 1. 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文