灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因功能研究

论文摘要

灰葡萄孢是一种寄主范围广泛,危害特别严重的植物致病真菌。我们的前期研究表明灰葡萄孢BcChsⅤ基因敲除后几丁质含量增加了31%,而致病力无明显变化。由于BcChsⅥ与BcChsⅤ相似,都具有肌动蛋白头结构域,所以本实验对BcChsⅥ价基因功能进行研究。实验通过Gateway技术构建BcChsⅥ基因敲除双元载体pCAMBIA-Bar-chs6,并采用根癌农杆菌介导法转化灰葡萄孢得到了 5个稳定的转化子,经PCR和RT-PCR分子鉴定确证其中2个为阳性转化子即Bcchs6-7和Bcchs6-8突变株。随后,对野生型菌株和Bcchs6突变株进行了一系列生物学特性实验研究,包括表型观察,生长速率测定,药物敏感性测定,山梨醇挽救实验,几丁质含量测定以及致病性检测等,结果表明,Bcchs6突变株较野生型菌株生长稀疏、低矮,气生菌丝极其不发达,菌丝出现坏死和破裂现象,且无菌核形成,生长速率下降,对细胞壁和细胞膜抑制性药物显著敏感,几丁质含量增加45.5%,致病能力显著下降。此外,我们还进行了灰葡萄孢Bcchs6突变株的遗传互补研究,通过构建重组质粒pETHG-BcChsⅥ,然后经LR反应成功获得了具有草铵膦抗性筛选标记的双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ,再将双元载体导入农杆菌AGL-1感受态细胞中,同样经农杆菌介导的转化实验获得3株Bcchs6突变株遗传互补转化子,实验发现互补菌株生物学特性有所恢复。经正反两方面对BChsⅥ基因的研究分析,可以推测BcChsⅥ基因对灰葡萄孢菌株生长、几丁质合成和致病侵染力均有重要影响,说明BcChsⅥ基因在保证灰葡萄孢细胞壁完整性,维持真菌正常生长等方面非常重要。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 丝状真菌几丁质合酶基因研究进展
• 1.2.1 丝状真菌中几丁质合酶Ⅲ类基因研究进展
• 1.2.2 丝状真菌中几丁质合酶Ⅴ和Ⅵ类基因研究进展
• 1.3 丝状真菌中基因敲除技术研究进展
• 1.3.1 基因敲除概念和原理
• 1.3.2 丝状真菌基因敲除研究进展
• 1.4 选题意义
• 第二章 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因敲除突变株的构建及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 主要供试试剂和仪器
• 2.1.4 载体和引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 重组质粒pETHG-C6D的构建
• 2.2.1.1 克隆BcChsVI基因上下游片段
• 2.2.1.2 纯化PCR产物
• 2.2.1.3 C6D片段的TA克隆
• 2.2.1.4 构建重组质粒pETHG-C6D
• 2.2.2 入门载体pETHG-C6U-C6D的构建
• 2.2.2.1 C6D片段的TA克隆
• 2.2.2.2 重组入门载体pETHG-C6U-C6D
• 2.2.3 双元载体pCAMBIA-Bar-chs6的构建
• 2.2.4 双元载体pCAMBIA-Bar-chs6转入农杆菌AGL-1感受态细胞
• 2.2.5 根癌农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化
• 2.2.5.1 菌株的活化和培养
• 2.2.5.2 农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化
• 2.2.5.3 灰葡萄孢Bcchs6突变株的保种
• 2.2.6 灰葡萄孢Bcchs6突变株的鉴定
• 2.2.6.1 利用引物对ChsF1-ChsR1进行PCR鉴定
• 2.2.6.2 利用引物对ChsF1-HptR进行PCR鉴定
• 2.2.6.3 利用引物对ChsF2- ChsR2进行RT～PCR鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.4 小结
• 第三章 灰葡萄孢B05.10中BcChsⅥ基因功能的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 主要培养基
• 3.1.3 主要供试试剂和仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 表型观察和生长速率测定
• 3.2.2 药物敏感性测定
• 3.2.3 山梨醇挽救实验
• 3.2.4 Bcchs6突变株几丁质含量测定
• 3.2.4.1 分光光度计法制作葡萄胺含量标准曲线
• 3.2.4.2 测定Bcchs6突变株中几丁质含量
• 3.2.5 Bcchs6突变株致病性检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Bcchs6突变株表型和生长速率
• 3.3.1.1 Bcchs6突变株表型
• 3.3.1.2 Bcchs6突变株生长速率
• 3.3.2 药物敏感性实验结果
• 3.3.3 山梨醇挽救实验
• 3.3.4 葡萄胺含量标准曲线的制作
• 3.3.5 测定Bcchs6突变株几丁质含量
• 3.3.6 Bcchs6突变株致病性检测
• 3.4 小结
• 第四章 灰葡萄孢Bcchs6突变株遗传互补的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 主要培养基
• 4.1.3 主要供试试剂和仪器
• 4.1.4 载体和引物
• 4.2 方法
• 4.2.1 高保真酶扩增几丁质合酶BcChsⅥ基因全序列
• 4.2.2 几丁质合酶BcChsⅥ基因的TA克隆
• 4.2.2.1 目的基因的切胶回收
• 4.2.2.2 目的基因的TA克隆
• 4.2.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ
• 4.2.3.1 获取入门载体pETHG
• 4.2.3.2 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的构建
• 4.2.3.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的鉴定
• 4.2.4 构建双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ
• 4.2.4.1 获取目的载体pCAMBIA-Bar-RfA
• 4.2.4.2 LR反应
• 4.2.4.3 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ的获得
• 4.2.4.4 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ转化农杆菌AGL-1感受态细胞
• 4.2.5 根癌农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化
• 4.2.5.1 菌株的活化和培养
• 4.2.5.2 农杆菌AGL-1介导的灰葡萄孢转化
• 4.2.5.3 互补转化子的保种
• 4.2.6 互补转化子的生物学特性分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 几丁质合酶BcChsⅥ基因全序列的扩增
• 4.3.2 目的基因BcChsⅥ的TA克隆
• 4.3.3 重组质粒pETHG-BcChsⅥ的构建
• 4.3.4 双元载体pCAMBIA-Bar-BcChsⅥ的构建
• 4.3.5 互补转化子的获得及生物学特性分析
• 4.4 小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文