论文摘要
抗菌肽（antibacterial peptides,简称ABP）是一类由结构基因编码产生的小分子肽类物质,广泛存在于生物体内,是构成其自身免疫体系的重要组分,能非特异性的抗细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体,且对肿瘤细胞、多重耐药菌也有明显的杀伤作用,且对正常生物体细胞无害,作用的机理非常独特,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药,成为目前生命科学领域研究中的一大研究热点。家蝇从幼虫到成虫常生活在垃圾堆、禽畜粪便等有多种病原菌孳生的环境中,携带多种有害病原微生物,能在人、畜中通过机械传播多种疾病,自身却不会因为感染病原菌而死亡,这可能缘于其独特的天然免疫活性物质抵抗各种微生物的浸染,抗菌肽在其中起着主要的作用。家蝇在我国分布广泛,容易饲养,且养殖的成本较低,在医药开发应用方面是一个很好的昆虫资源。但从家蝇体内提取天然抗菌活性物质的成本较高,人工合成也较昂贵,通过基因工程方法可能是规模制备其抗菌肽的理想途径之一,而该方法的前提是要获取其有关的抗菌肽基因。基因芯片技术是近年来新兴的一种分子生物学技术,具有快速、高效、敏感、平行性等许多优点,克服了传统方法一次只能研究一条或少数几条基因的局限性,在基因差异表达的筛选、新基因的发现、突变基因的检测及基因多态性分析等方面显示出了很好的应用前景。用该技术用于家蝇抗菌肽相关基因的筛选研究还未见报道,本研究以GenBank中部分昆虫抗菌肽基因序列为目标设计寡核苷酸（oligonucleotide）探针,制备成寡核苷酸（oligo）芯片,以筛选家蝇抗菌肽相关基因,并对所筛选出的其中一个基因的cDNA序列进行克隆,运用生物信息学软件进行初步分析。研究目的运用基因芯片技术筛选家蝇抗菌肽相关基因,对其中筛选出的一个基因的cDNA序列进行克隆分析,为进一步研究家蝇抗菌肽结构和功能,揭示其在家蝇天然免疫体系中所起的作用,进而为用基因工程方法生产家蝇抗菌肽打下基础。研究方法1.家蝇抗菌肽基因芯片的制备与相关基因的筛选从GenBank数据库中获取部分昆虫抗菌肽基因序列,运用NCBI中相关服务器对各基因的全长进行分析,找出其编码区,分析出各自的保守序列,以此作为设计oligo探针的备选序列,用生物学软件Array Designer 2.0对所选序列设计特异性高、Tm值接近、长度均一的oligo探针,用直接点样法将探针点印在特制玻片上制备成寡核苷酸（oligonucleotide）芯片;提取经大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）免疫诱导后24小时的家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA,逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3,与制备的基因芯片杂交,经洗片、扫描处理后进行数据分析。2.一个家蝇新抗菌肽基因cDNA的克隆与生物信息学分析对筛选出的其中一个有效杂交信号点所对应基因的氨基酸保守域设计简并引物,行RT-PCR扩增出一个同源片断;结合cDNA文库（本实验室已构建）载体上的下游引物,从所克隆到的同源片断中设计出一条特异性上游引物,以cDNA文库为模板,行PCR扩增出该基因的3′端;再结合文库载体上的上游引物,从所克隆到的3′端序列中设计出一条特异性下游引物,以cDNA文库为模板,行PCR扩增出该基因的5′端;将两次所克隆到的cDNA片断进行拼接,获得一条家蝇新抗菌肽基因的cDNA序列,并运用生物信息学相关软件对其进行初步分析。研究结果1.家蝇抗菌肽基因芯片的制备与相关基因的筛选据GenBank数据库中所获取的部分昆虫抗菌肽基因序列,用NCBI中相关生物学软件分析出各自的保守序列,根据oligo探针的设计原则,用ArrayDesigner 2.0生物学软件共设计出长度为50bp、Tm为72～77℃、GC含量为40～60%的oligo探针186条,将之点印在特制玻片上制备成oligo芯片;用逆转录PCR标记技术对诱导后家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA反转录成cDNA并进行Cy3荧光素标记,与制备的芯片杂交,经洗片、扫描后进行数据分析,在两次重复杂交实验中均能检测到有效杂交信号的基因点共有15个,在其中一次杂交实验中检测到有效杂交信号的基因点共12个,其中所有阳性对照信号清晰,阴性对照和空白对照均为阴性。2.一个新抗菌肽基因cDNA的克隆与生物信息学分析对其中一个有效杂交信号的基因点所对应基因的氨基酸保守域设计简并引物,经RT-PCR扩增出一长为131bp的同源片断;结合cDNA文库载体上的上、下游引物,以cDNA文库为模板,分别行PCR扩增出长为366bp的3′端cDNA序列和457bp的5′端cDNA序列,将所得3′端与5′端cDNA序列进行拼接,得到一长为460bp的家蝇抗菌肽新基因的cDNA序列,生物信息学分析该基因序列所编码的蛋白质属于抗菌肽Attacin基因家族,其cDNA序列的3′端是完整的,存在有一个AATAAA的poly（A）加尾信号和一个poly（A）尾巴,但5′显示还不完整,Blast比较显示与双翅目刺舌蝇、新陆原伏蝇抗菌肽Diptericin基因的同源性较高,分别为80%、91%,推导出的所编码的氨基酸序列Blast比较显示与舌刺蝇Diptericin氨基酸序列同源性为77%、与果蝇Diptericin氨基酸序列同源性为59%、与新陆原伏蝇Diptericin氨基酸序列同源性为51%,初步判断该cDNA序列可能为家蝇一新抗菌肽基因。结论1.首次制备了家蝇抗菌肽相关基因芯片,并初步筛选到了27个可能与家蝇抗菌肽相关的基因,为进一步克隆其新抗菌肽基因奠定了良好的工作基础;2.对其中一个有效杂交信号的基因点所对应的基因进行了克隆,成功克隆到了一长为460bp的家蝇新抗菌肽基因,并对其进行了相关的生物信息学分析,为下一步研究家蝇抗菌肽结构和功能,揭示其在家蝇天然免疫体系中所起的作用,进而为用基因工程方法生产家蝇抗菌肽打下了基础。
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