NK细胞发育及蜕膜NK细胞在胚胎耐受中的功能

论文摘要

自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK cells）是天然免疫系统的重要成员,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统。不同与T、B细胞,NK细胞无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并分泌多种细胞因子及趋化因子,具有杀伤微生物及招募免疫系统中其他细胞等多种生物学功能,从而在抗击感染,自身免疫病及肿瘤等多种疾病中发挥重要功能。近期越来越多的研究发现,NK细胞除杀伤肿瘤的能力外,更具有调节免疫系统和维持免疫平衡的功能。尤其是在妊娠早期,超过80%的母胎界面淋巴细胞均为NK细胞,而其免疫学功能至今不为人知。与此同时胎儿作为一种异基因移植物,却能够建立和维持妊娠的进行,这些都无法用经典的移植免疫耐受或肿瘤免疫逃逸理论来解释。因此,对NK细胞的调控功能,尤其对胚胎耐受的机理的研究,不仅对妊娠免疫极其重要,对研究移植免疫及临床NK细胞治疗也都有重要意义。与T细胞和B细胞相比,对NK细胞发育及其功能的认识至今仍然比较有限。为了更好的研究NK细胞在胚胎耐受中的作用,首先要了解蜕膜NK细胞的特征。蜕膜NK细胞在基因谱表达,发育阶段和功能上都与外周NK细胞有很大不同。为了进行NK细胞发育方面的研究,我们在研究中选取了三种不同组织来源的人的NK细胞:分别是外周血NK细胞,脐血NK细胞和蜕膜NK细胞。研究结果表明采用CD11b和CD27表面分子可以将人NK细胞划分为四个不同阶段。而蜕膜NK细胞与另外两种外周NK细胞相比,处于发育的早期。超过90%的外周血NK细胞都是CD11b+CD27-细胞亚群,而脐血NK细胞则80%是CD11b+CD27-NK亚群,20%是CD11b+CD27+NK亚群。有趣的是,研究中发现超过60%的人蜕膜NK细胞为CD11b-CD27-细胞亚群,这与外周NK细胞截然不同。这群CD11b-CD27-NK细胞表现出不成熟的特征,高表达NKG2A,并且具有向其他亚群细胞分化的潜能。从而更进一步验证了蜕膜NK细胞是处于发育早期的细胞群体。同时,本研究还证明了这四个不同亚群的NK细胞的功能也有所区别。CD11b-CD27+和CD11b+CD27+ NK细胞亚群在四个群体中分泌细胞因子的能力最强,CD11b+CD27-NK细胞主要表现为杀伤功能。因此,本研究表明不同组织来源的人NK细胞处于发育的不同阶段,并且具有不同的功能特征,从而建立了一种区分人NK细胞分化的新模型。同时,我们也验证了蜕膜NK细胞具有与外周NK不同的特性,包括有大量的具有发育分化潜能的CD11b-CD27-NK细胞、能分泌细胞因子的CD11b-CD27+和CD11b+CD27+NK细胞亚群。蜕膜NK细胞在发育上显示了与外周NK细胞所不同的独特特性,且在妊娠过程中又在母胎界面大量聚集,那么它在妊娠中行使的功能和相关的机制到底是怎样的呢?本研究发现在妊娠前三个月的蜕膜组织中有70%以上的淋巴细胞为NK细胞,而T细胞极少,低于10%。并且这些蜕膜NK细胞有20%以上的比例为CD56brightCD27+NK细胞,大大高于外周NK低于5%的该亚群比例。并且,随着妊娠的终结,晚期蜕膜局部的CD56brightCD27+NK细胞逐渐减少,伴随着T细胞增多,逐渐接近外周中的细胞比例。此外CD56brightCD27+NK细胞还是NK细胞中分泌IFN-γ等细胞因子的主要群体。那么只在妊娠早期,也就是胚胎植入最关键时间出现的CD56brightCD27+NK细胞究竟扮演了什么样的角色呢?胎儿作为异基因移植物,在妊娠早期为了成功植入并生长,胎儿的滋养层细胞不停的入侵母体。在入侵的过程中必然引发一定的炎症反应。如何控制炎症反应,使之维持在温和平衡的范畴内,是胚胎耐受的关键问题。而TH17细胞,作为炎症过程中关键的致炎细胞,在很多疾病模型中发挥作用。我们检测了正常妊娠早期蜕膜组织中TH17细胞,发现正常妊娠中有2%以内的TH17细胞,显示了轻微的炎症。考虑到IFN-γ可以抑制TH17的极化,我们分别用外周血NK细胞和正常人蜕膜NK细胞证明,在正常妊娠中NK细胞可以通过分泌IFN-γ抑制TH17极化,从而维持胚胎耐受和免疫平衡。在因免疫原因反复流产病人中,我们发现其母胎界面局部有严重的炎症迹象,病理组织破损情况和浸润的TH17数量都有显著地上升。病人蜕膜NK细胞分泌抑制炎症的细胞因子IL-1RA等减少,NK比例下降,使得NK不能有效抑制TH17细胞极化。而与此同时,蜕膜中其他细胞却分泌大量IL-6和IL-1β等促进炎症因子,使炎症加剧。为了验证妊娠失败是否与TH17细胞的增加相关,我们还研究了自发流产经典模型CBA/J×DBA/2杂交小鼠的妊娠状态。结果显示,CBA/J×DBA/2孕鼠在妊娠第10天母胎界面与对照组相比有更多的TH17细胞浸润。进一步通过转输体外培养的TH17细胞,导致CBA/J×Balb/c小鼠也出现了胚胎吸收的流产现象。由此说明,大量的TH17的确会直接导致妊娠失败。综上所述,本研究证明CD11b和CD27标志可以将人的NK细胞划分为CD27-CD11b- NK细胞（DN NK细胞）、CD27+CD11b-NK细胞、CD27+CD11b+NK细胞（DP NK细胞）和CD27-D11b+NK细胞等四个具有不同功能的细胞亚群,蜕膜NK细胞处于发育的早期,并包含大量不成熟的DN NK（CD27-CD11b-）细胞。此外,本研究发现蜕膜NK细胞可以通过抑制炎性TH17细胞,维持母胎耐受和免疫平衡,并且这一过程是通过CD56brightCD27+NK细胞所分泌的IFN-γ和IL-1RA等细胞因子实现的。反复流产病人蜕膜组织中分泌的大量IL-6和IL-1β等炎症因子,促进了TH17细胞极化,导致炎症加剧;同时CD56brightCD27+NK细胞的比例下降,分泌IFN-γ减少,不能有效抑制TH17细胞的形成,母胎耐受平衡被打破,造成妊娠失败。本研究发现NK细胞能够作为调节性细胞抑制炎性反应,维持耐受平衡,保障妊娠正常进行的免疫学功能,对更好的理解NK细胞的调节功能,深入研究胚胎耐受的机理有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 表序
• 图序
• 缩略词表
• 第1章 绪论：NK细胞的发育及其在胚胎耐受中的作用
• 1.1 引言
• 1.2 NK 细胞的发育
• 1.2.1 NK 细胞发育场所
• 1.2.2 NK 细胞发育条件
• 1.2.3 NK 细胞的异质性
• 1.3 NK细胞在胚胎耐受中的作用
• 1.3.1 胚胎耐受
• 1.3.2 胚胎耐受的免疫学机制
• 1.3.3 蜕膜NK 细胞
• 1.3.4 NK 细胞的免疫调节功能
• 1.3.5 NK 细胞在胚胎耐受中的作用
• 参考文献
• 第2章 CD11b和CD27界定人NK细胞四个功能亚群
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料仪器及方法
• 2.2.1 实验材料及方法
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 CD11b和CD27 区分不同发育阶段的NK 细胞
• 2.3.2 CD11b和CD27 划分的NK 细胞亚群与其它NK 亚群之间的关系
• 2.3.3 DN NK 细胞亚群是不成熟NK 细胞
• 2.3.4 DN NK 细胞亚群具有发育分化潜能
• 2.3.5 CD27+SP 和DP NK 细胞亚群是细胞因子的主要来源
• 2.3.6 CD11b+SP NK 细胞主要行使杀伤作用
• 2.4 讨论及总结
• 参考文献
• 第3章 蜕膜 NK 细胞调控TH17细胞促进母胎耐受
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料及方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 人早期妊娠蜕膜富含CD56brightCD27+NK细胞
• 3.3.2 正常妊娠母胎界面少量存在TH17细胞
• 3.3.3 正常妊娠蜕膜NK 细胞通过IFN-γ抑制TH17维持免疫平衡
• 3.3.4 反复流产病人TH17细胞显著增加与炎性微环境相关
• 3.3.5 反复流产病人中NK 细胞变化
• 3.3.6 反复流产病人蜕膜NK 细胞不能有效抑制TH17 细胞
• 3.3.7 反复流产病人蜕膜炎症损伤加剧
• 3.3.8 小鼠反复流产模型验证TH17会导致流产
• 3.4 讨论及总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间取得的研究成果
• 论文发表
• 学术会议
• 获得奖励