高糖及氟伐他汀对HK-2细胞增殖、细胞凋亡及klotho蛋白的影响

论文摘要

随着社会经济发展和人们生活方式改变,人类疾病谱正在发生变化。2007年全球糖尿病患者已达246,000,000,到2025年WHO预计全球糖尿病患者将达380,000,000。在美国、欧洲等主要的发达国家,糖尿病尤其是2型糖尿病已成为终末期肾脏病（ESRD）最常见的病因;在中国、东南亚等发展中国家,糖尿病导致ESRD的比率也逐渐上升,给家庭和社会带来巨大的经济负担和医疗压力。据全美健康与营养调查显示近10%成人服用他汀类药物,超过1/4老人正服用他汀类药物。他汀类药物即羟甲基戊二酰辅酶A（hydroxy -methyl-glutaryl coenzyme A, HMG-CoA）还原酶抑制剂,它通过竞争性抑制HMG-CoA转为甲羟戊酸（mevalonate,MVA）,抑制胆固醇生物合成,发挥降低低密度脂蛋白胆固醇（low -density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、降低甘油三酯、升高高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）的调脂作用。既往认为他汀类药物的益处来源于其降低血清总胆固醇及LDL-C,近来研究认为他汀类药物具有多样性作用,此作用独立于其降脂作用而存在。其原因目前认为与MVA通路的类戊二烯化合物等有关。他汀抑制MVA合成的同时,也抑制MVA通路中辅酶Q、鲨烯、焦磷酸法尼酯（farnesyl pyrophosphate, FPP）、焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯（granylgeranyl pyrophosphate, GGPP）等合成;其中FPP、GGPP可经过翻译后修饰参与细胞分化、增殖,调节多种信号转导过程,从而发挥他汀的多样性作用。目的:本研究主要通过体外实验探讨氟伐他汀（Flv）及高糖（HG）对人肾小管上皮细胞（HK-2）细胞增殖、细胞凋亡及klotho蛋白的影响,并探讨其作用机制。方法:正常糖（5.5mmol/L, NG）、甘露醇、HG（25.0mmol/L）伴/不伴不同浓度的Flv（0.01μmol/L1mmol/L）培养HK-2,伴/不伴MVA、GGPP、FPP,干预不同时间（0h、12h、24h、48h、72h）,采用苯唑氮蓝法（MTT）检测HG及Flv对细胞增殖的影响,Hoechst33258试剂盒检测细胞凋亡形态学变化,western blot检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-8（caspase-8）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9（caspase-9）、klotho、RhoA蛋白表达。结果:HG培养HK-2 2448h促进细胞增殖P<0.05,HG培养72h细胞增殖下降P<0.05。NG环境下（0.01μmol/L1mmol/L）Flv抑制HK-2细胞增殖。HG环境下（0.1μmol/L10μmol/L）Flv抑制HK-2细胞增殖,细胞增殖抑制率具有时间-浓度依赖性。10μmol/L Flv干预72h,细胞增殖抑制率>50%。HG诱导HK-2细胞凋亡小体增加,与0h相比P<0.05;HG环境下10μmol/L Flv干预后,HK-2细胞凋亡率也增加,两者均具有时间依赖性。HG环境下,不同浓度Flv干预72h,荧光显微镜下见0.1、1μmol/L Flv细胞凋亡减少P<0.05; 10μmol/L Flv诱导HK-2细胞凋亡变化不明显,与HG组相比P>0.05。western blot结果显示HG、Flv分别培养HK-2,caspase-3、caspase-8、caspase-9均活化增加,HG环境下10μmol/L Flv活化caspase-3、caspase-8、caspase-9表达。HG环境下不同浓度Flv比较,0.1、1μmol/L Flv干预后caspase-3、caspase-9、caspase-8均表达减少;10μmol/L Flv干预后,于HG相比caspase-3、caspase-9表达减少,caspase-8无显著差别。NG培养下Flv上调klotho蛋白。HG下调HK-2 klotho蛋白表达,HG环境Flv干预后,HK-2 klotho蛋白表达部分恢复,与HG比较P<0.05;此作用可被MVA、GGPP逆转,FPP不能逆转。同时HK-2 RhoA蛋白表达在高糖环境下增加P<0.05,Flv干预后RhoA蛋白表达下降,与未干预组比较P<0.05。结论:HG对HK-2细胞增殖出现双重效应,HG干预2448h促进细胞增殖;HG干预72h细胞增殖下降。NG培养下,0.01μmol/L1mmol/L Flv抑制HK-2细胞增殖。HG环境下0.110μmol/L Flv抑制HK-2细胞增殖,且具有时间、浓度依赖性。10μmol/L Flv干预HK-2 72h,细胞增殖抑制率>50%。HG诱导HK-2细胞凋亡;Flv诱导NG培养HK-2细胞凋亡,两者均具有时间依赖性。10μmol/L Flv与HG对HK-2细胞凋亡无明显协同作用;HG环境下低浓度Flv（0.1、1μmol/L）可改善HG诱导的HK-2细胞凋亡。HG抑制HK-2 klotho蛋白表达,NG、HG环境下,Flv均上调klotho表达。Flv通过MVA通路、影响GGPP异戊烯化,抑制RhoA/Rho激酶信号,上调klotho蛋白表达。低浓度Flv通过上调klotho蛋白表达,下调caspase-9、caspase-8,下调caspase-3蛋白表达,改善HG诱导的HK-2细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 氟伐他汀及高糖对HK-2 细胞增殖影响
• 摘要
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 氟伐他汀及高糖对HK-2 细胞凋亡的影响及机制研究
• 摘要
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 氟伐他汀及高糖对HK-2 klotho 蛋白表达的影响及机制研究
• 摘要
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录 中英文缩略词表
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢