齐口裂腹鱼生长激素基因的克隆、原核表达及生物活性初步研究

论文摘要

本研究选用齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti）作为实验材料,从齐口裂腹鱼脑垂体中提取总RNA。设计合成了一对齐口裂腹鱼生长激素基因的特异性引物,上游引物加入EcoRⅠ酶切位点;下游引物加入XholⅠ酶切位点。应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术克隆得到编码齐口裂腹鱼生长激素（SGH）基因的cDNA,并定向克隆到pMD18-T载体上。正反向测序结果分析表明:克隆的齐口裂腹鱼生长激素基因cDNA全长633bp,包含完整的开放阅读框（ORF）,编码210个氨基酸。生物信息学分析结果表明其分子量为23.55KD,等电点为5.46;疏水氨基酸占36.7%,亲水氨基酸占28.57%,碱性氨基酸占10.47%,酸性氨基酸占12.38%。将得到的序列在GenBank和EMBL数据库中进行了同源比较,结果显示:本研究克隆到的齐口裂腹鱼GH基因与GenBank中登记的其他鲤科鱼类的生长激素基因的同源性在92%-97%之间,影响蛋白质高级结构的保守二硫键为2个。将齐口裂腹鱼生长激素成熟肽（mSGH）基因片段定向插入融合表达载体pET-32a（+）质粒中,转化大肠杆菌BL21,用PCR方法筛选阳性克隆;以XholⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定重组质粒。以IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分析表明mSGH以融合蛋白的形式得到了表达,分子量约为41KD,与预期的大小一致。融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的42.6%。证明所构建的齐口裂腹鱼GH的重组质粒能高效表达,命名为pET-mSGH。通过投喂齐口裂腹鱼幼鱼实验结果表明:实验组幼鱼食量明显增强,体重和体长的增长率分别比对照组高20.82%和17.35%,证明该蛋白具有生物活性。为进一步开展齐口裂腹鱼生长激素的应用、真核表达研究及研制新型调节鱼类生长的基因制剂的应用奠定了的基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1、鱼类生长激素的分子生物学研究进展
• 1.1 鱼类生长激素基本结构的研究进展
• 1.2 鱼类生长激素基因的分离、克隆、与序列分析
• 1.3 鱼类GH基因的调控机制
• 2、鱼类生长激素的生理功能的研究进展
• 2.1 促生长作用
• 2.2 渗透调节作用
• 2.3 参与应激反应
• 2.4 与其它激素的相互作用
• 2.5 其它作用
• 3、外源生长激素引入鱼体的途径和方法研究进展
• 3.1 GH引入鱼体的途径和方法
• 3.2 消化道对GH的吸收
• 3.2.1 硬骨鱼类小肠吸收GH的能力
• 3.2.2 外源GH到达肠内吸收位点并进入血液的主要障碍
• 3.2.3 GH保护剂的研制
• 3.3 前景
• 4、鱼类生长激素在水产养殖中的应用
• 4.1 优化养殖的环境因子与营养条件,有利于鱼类GH的正常分泌
• 4.2 转基因鱼的研究进展
• 4.3 生长激素基因工程研究进展
• 第二章 齐口裂腹鱼生长激素基因的克隆
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 齐口裂腹鱼脑垂体的分离和总RNA的提取
• 2.2 齐口裂腹鱼生长激素基因的克隆
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 RT-PCR扩增
• 2.2.3 RT-PCR产物的回收
• 5α感受态细胞的制备'>2.2.4 大肠杆菌DH_5α感受态细胞的制备
• 2.2.5 目的片段与pMD18-T载体连接与转化
• 2.2.7 重组质粒的PCR鉴定
• 2.2.8 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.9 重组质粒的序列测定
• 2.4 齐口裂腹鱼生长激素基因生物信息学分析
• 2.5 齐口裂腹鱼生长激素基因的系统进化树分析
• 3 结果
• 3.1 齐口裂腹鱼生长激素基因的克隆
• 3.2 重组质粒PCR鉴定
• 3.3 重组质粒的酶切鉴定
• 3.4 序列测定
• 3.5 齐口裂腹鱼生长激素基因生物信息学分析
• 3.6 生长激素基因的系统进化树分析
• 4 讨论
• 第三章 齐口裂腹鱼生长激素基因成熟蛋白的原核表达
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 溶液配制
• 2 方法
• 2.1 齐口裂腹鱼GH成熟蛋白基因的克隆
• 2.2 成熟蛋白基因重组表达质粒的构建
• 2.3 成熟蛋白基因重组表达质粒的诱导表达
• 2.3.1 SDS-PAGE
• 2.3.2 IPTG诱导浓度的优化
• 2.3.3 诱导时间的优化
• 2.3.4 重组成熟蛋白诱导表达
• 2.3.5 重组成熟蛋白的可溶性检测
• 2.4 重组成熟蛋白的纯化回收
• 2.5 蛋白浓度测定
• 2.6 GH重组成熟蛋白的Western-blot鉴定
• 2.6.1 蛋白质样品制备
• 2.6.2 湿法转移电泳
• 2.6.3 免疫学反应
• 2.6.4 NC膜的显色
• 2.6.5 NC膜照相保存
• 2.7 饲喂实验
• 3 结果
• 3.1 齐口裂腹鱼GH成熟蛋白基因的克隆
• 3.2 酶切鉴定
• 3.3 诱导表达和可溶性检测
• 3.4 原核表达条件的优化
• 3.4.1 IPTG浓度对齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白诱导表达的影响
• 3.4.2 诱导表达时间对齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白表达的影响
• 3.5 Western-blot鉴定
• 3.6 齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白的纯化回收
• 3.7 蛋白浓度测定
• 3.8 饲喂实验
• 4 讨论
• 4.1 齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白表达载体的选择
• 4.2 齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白表达条件的优化
• 4.3 齐口裂腹鱼GH重组成熟蛋白的纯化
• 4.5 生长激素的饲喂
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录