抗黄曲霉素B1抗独特型多抗的制备及其性质分析

论文摘要

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）是由寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和产毒黄曲霉（A. flavus）代谢产生,是目前已分离的十几种黄曲霉毒素中最重要和毒性最大的毒素。AFB1主要污染大米、玉米、花生、花生油和动物肝脏、干咸鱼以及核桃、椰奶等农副产品。世界上几乎所有的国家和地区都规定了食品及饲料中AFB1的最大允许含量并将其作为强制性标准进行检测和控制。目前常用的检测AFB1的方法主要有薄层色谱法（thin layer chromatography, TLC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）、以酶联免疫为基础的免疫分析以及生物传感器法等。这些方法虽各有优缺点,但都需要使用高浓度的AFB1标准品,检测人员对于频繁接触AFB1这种强致癌物质有很强的戒备心理；同时,AFB1标准品需要从国外进口,价格高昂,导致检测成本偏高。而一种新型的免疫试剂——抗独特型抗体（anti-idiotype antibody, Aid）,由于其在空间构象上与AFB1毒素抗原存在着所谓的内影像（internal image）关系,所以有望作为AFB1替代品用于AFB1的免疫学检测,从而实现AFB1的无毒检测,降低检测成本。本实验目的在于通过制备AFB1抗独特型抗体来替代免疫学检测中的毒素标准品,从而建立无毒ELISA检测体系。实验首先采用胃蛋白酶酶切法对兔抗黄曲霉毒素抗体酶切,采用糖蛋白A柱分离纯化制得F（ab’）2,并采用SDS-PAGE.琼脂糖双向扩散法对其进行了分析鉴定。随后,分别采用片段和完整抗体分子免疫了BALB/c小鼠,研究了不同免疫原产生的抗血清的差异,并采用ELISA对抗独特型抗体与毒素AFB1间的替代关系进行了研究,具体内容如下。1.抗AFB1兔抗体的纯化及其酶切条件的优化本研究首先以AFB1-BSA免疫日本大耳白兔得到的兔多克隆抗体为材料,采用饱和（NH4）2804盐析法对抗体进行纯化,采用SDS-PAGE和ELISA对纯化抗体进行了鉴定。以此为材料,采用胃蛋白酶酶切制备F（ab’）2片段,并以蛋白A亲和层析法进行分离纯化,以SDS-PAGE、双向扩散法对F（ab’）2片段的特性进行了分析。以50%-33%-33%饱和（NH4）2804三步盐析法纯化抗体,回收率为25.7%。纯化后,在体积不变的基础上,抗体效价值从最初的7.88×105降为2.56×105,在原来基础上降低3倍,灵敏度都在20ng/mL左右,基本无变化。电泳结果显示,经纯化,大量杂蛋白被除去,得到的蛋白质大多数为IgG,基本达到电泳纯。采用胃蛋白酶酶切IgG,通过对酶解条件的分析,得到最优水解条件为：0.4 mol/L NaAc, pH 4.0,酶与抗体比例为1：10（w/w）,37℃水浴锅内反应4h；酶切前酸化前后抗体的比效价稍微有些下降,但变化不大。2.抗独特型抗体的制备及其性质研究以上述纯化得到的抗AFB1抗体（anti-AFB1 antibody, Ab1）及其酶解片段F（ab’）2为抗原,分别免疫BALB/c小鼠,制备它们的抗独特型抗体（anti-idotype antibody, Ab2）。以Ab1为免疫原时,免疫剂量为50 gg/次/只,共3只（1-3号）小鼠,免疫周期为14d；以F（ab’）2为免疫原时,免疫剂量为100μg/次/只,共3只（4-6号）小鼠,免疫周期为14d。抗体产生进程分析结果表明,小鼠均对Ab1和F（ab’）2产生了很好的免疫应答,制备得到了相应的Ab2。在此基础上,对Ab2的性质进行了分析,结果如下。采用pH分别为6.0、7.4、8.0的PBS （phosphate buffered saline）,以及pH为9.6的CBS （carbonate buffer solution）等不同pH缓冲液对Abl的包被条件进行了研究。结果表明,pH 8.0的PBS缓冲液为最优包被液。以该pH值的缓冲液包被Abl,对2号小鼠Ab2血清做方阵滴定试验,确定Abl最佳包被浓度为0.25μg/mL。采用上述包被条件,对各小鼠Ab2抗血清的ELISA效价进行了分析。结果表明,1、2、3号小鼠的Ab2的ELISA效价分别为1：1.02×106、1：1.02×106、1：2.05×106；4、5、6号小鼠的效价为1：3.2×104、1：6.4×104、1：1.6×104。由此可以看出,以完整分子免疫的抗体Abl为抗原的效价要明显高于其片段F（ab’）2的效价。初步推断,抗体的Fc片段可以增强小鼠的免疫应答。进一步以1μg/mL AFB1-cOVA为包被抗原,以Ab1为抗体,采用间接竞争ELISA对Ab2的性质进行了分析。结果表明,以AFB1标品对Ab1做标准曲线时,灵敏度为6.82 ng/mL;以2号小鼠的Ab2对Ab1做标准曲线时,灵敏度为85.51μg/mL,相当于6.82 ng/mLAFB1,检测限为0.65μg/mL,线性范围为0.01-200μg/mL；以4号小鼠的Ab2对Ab1做标准曲线时,灵敏度为28.24μg/mL;相当于6.82ng/mLAFB1,检测限为0.01μg/mL,线性范围为0.01～100μg/mL。内影像实验表明,以4号小鼠的血清与AFB1的结构类似性优于2号小鼠,故以F（ab’）2片段为免疫抗原得到的Ab2质量优于以Ab1为抗原的Ab2,与文献报道的相同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 黄曲霉毒素简介
• 1.1 黄曲霉毒素的分子结构及理化性质
• 1.2 AFB1的危害
• 1.3 食品中AFT的限量标准
• 1.4 黄曲霉毒素B1的检测方法
• 1.4.1 理化检测方法
• 1.4.2 免疫学检测方法
• 1.4.3 生物学检测方法
• 2 抗独特型抗体
• 2.1 抗独特性抗体的由来——免疫网络学说
• 2.2 抗独特型抗体及其种类
• 2.3 抗独特型抗体的制备方法
• 2.3.1 多克隆Aid制备技术
• 2.3.2 单克隆Aid制备技术
• 2.3.3 基因工程技术制备Aid
• 2.4 抗独特型抗体的鉴定
• 2.4.1 抗AFB1抗独特型抗体亚型的鉴定
• 2.4.2 抗AFB1抗独特型抗体特异性的鉴定
• 2.5 抗独特型抗体的应用
• 2.5.1 应用于无毒免疫学检测
• 2.5.2 在疫苗研究中的应用
• 2.5.3 在自身免疫疾病治疗方面的应用
• 2.5.4 制备抗体酶
• 3 选题的目的和意义
• 第二章 抗体纯化及酶切片段的制备
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 抗AFB1兔多克隆抗体的纯化及其特性鉴定
• 2.1.1 实验试剂的准备
• 2.1.2 抗体的纯化
• 2.1.3 纯化血清的特性鉴定
• 2的制备'>2.2 兔血清抗体双片段F（ab'）₂的制备
• 2.2.1 酶切条件的优化
• 2.2.2 酶切片段的纯化
• 2特性的鉴定'>2.2.3 纯化前后双片段F（ab'）₂特性的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 抗黄曲霉毒素B1兔多克隆抗体纯化纯化前后的性质分析
• 3.1.1 抗体纯化前后效价分析
• 3.1.2 抗体纯化前后灵敏度分析
• 3.1.3 纯化前后抗体纯度检测
• 3.1.4 饱和硫酸铵三步盐析纯化抗体
• 2片段的制备及片段特性的鉴定'>3.2 纯化兔血清多克隆抗体F（ab'）₂片段的制备及片段特性的鉴定
• 3.2.1 酶切前酸化处理对抗体的影响
• 3.2.2 酶切条件的优化
• 3.2.3 酶切片段的纯化
• 3.2.4 酶切片段纯化前后纯度比较
• 3.2.5 酶切片段的滴度测定
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 抗体纯化
• 4.2.2 蛋白酶的选择
• 4.2.3 酶切条件的选择
• 4.2.4 分离纯化条件的选择
• 第三章 抗独特型抗体的制备及特异性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 ELISA相关溶液的配制
• 1.2.2 动物饲养及处理
• 1.2.3 免疫方法
• 1.2.4 抗独特型抗体（抗血清）的制备及分析
• 2 结果与分析
• 2.1 抗体产生进程
• 2.2 间接非竞争ELISA测定抗独特型多抗的效价
• 2.2.1 包被溶液pH值对包被抗原包被效果的影响
• 2.2.2 多克隆抗体效价的测定
• 2抗血清的间接竞争ELISA灵敏度分析'>2.3 抗Ab1和F（ab'）₂抗血清的间接竞争ELISA灵敏度分析
• 2免疫所得抗独特型抗体间接竞争ELISA的竞争抑制曲线'>2.3.1 Ab1和F（ab'）₂免疫所得抗独特型抗体间接竞争ELISA的竞争抑制曲线
• 2.3.2 Ab2与包被抗原（AFB1-cOVA）竞争Ab1中的AFB1结合位点
• 2抗血清同AFB1的内影像关系的初步研究'>2.3.3 抗Ab1和F（ab'）₂抗血清同AFB1的内影像关系的初步研究
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.1.1 包被条件的优化
• 3.1.2 抗独特型抗体血清间接非竞争ELISA分析
• 3.1.3 抗独特型抗体血清间接竞争ELISA及内影像关系的分析
• 3.2 讨论
• 3.2.1 抗原
• 3.2.2 实验动物
• 第四章 总结与展望
• 1 总结
• 1.1 抗体的纯化
• 2的制备及分离纯化'>1.2 抗体片段F（ab'）₂的制备及分离纯化
• 1.3 抗独特型多抗的制备及其内影像关系初步研究
• 2 展望
• 2.1 单克隆抗体的制备
• 2.2 抗独特型抗体的检测
• 2.3 ELISA无毒检测试剂盒的研制
• 参考文献
• 致谢