小麦-叶锈菌互作过程中激发子的纯化及其来源分析

论文摘要

本试验主要在课题组前期工作的基础上探讨激发子的来源问题。首先,试验选用叶锈菌（Puccinia recondita f.sp.tritici）165的培养液和其夏孢子萌发芽管的研磨液分别注射小麦洛夫林10叶片,观察它们对PAL和POD的诱导活性。发现二者可能不具备可诱导小麦叶片PAL和POD活性明显增强的激发子活性。随后,本试验选用小麦品种洛夫林10与叶锈菌小种165为材料组成亲和组合,从接种后第5天的小麦叶片中提取细胞间隙液（Intercellular washing fluids,IWF）,记作IWF165。用IWF165处理小麦洛夫林10悬浮细胞,对处理后不同时间点的悬浮细胞进行形态学观察和DNA电泳,以验证IWF165中是否存在可诱导悬浮细胞产生PCD的激发子,并希望建立一种简便可靠的激发子跟踪方法,为进一步纯化激发子奠定基础。IWF165经硫酸铵分级沉淀去除部分杂蛋白后,进行Sephadex G—100凝胶过滤柱层析,将对应于各洗脱峰部分的收集液分别处理洛夫林10的健康叶片和悬浮细胞,以PAL、POD和PCD作为评价诱导活性的指标,观察激发子在各峰液中的分布和诱导活性的强弱。在对具有激发子活性的凝胶过滤柱层析的洗脱峰1（F1）进行IEF—PAGE分析后,对其进行DEAE—纤维素离子交换柱层析,收集对应洗脱峰部分的收集液并脱盐后进行以下处理:（1）处理洛夫林10健康小麦叶片和悬浮细胞,以PAL、POD和PCD为指标检测激发子的活性;（2）进行SDS—PAGE电泳,检测纯化结果并测定激发子的分子量。本实验的目的是探究小麦—叶锈菌互作过程中激发子是来源于叶锈菌还是来源于小麦或是由二者互作产生,并对其进行纯化,为进一步研究激发子的组成和结构、激发子受体以及侵染信号的转导和防卫基因的表达调控等分子机制奠定基础。 试验结果表明:叶锈菌165夏孢子萌发芽管的研磨液和菌的水培液中可能不存在可诱导小麦叶片PAL和POD活性明显增强的激发子物质,然而用IWF165处理小麦叶片和悬浮细胞,发现其不仅可以诱导洛夫林10健康叶片的PAL和POD的活性明显升高,而且还可以诱导小麦悬浮细胞发生PCD,充分证明了IWF165中有激发子物质存在,随后对IWF165中激发子成分进行了分离纯化。对IWF165经凝胶过滤后各峰液的活性测定表明:IWF165的峰1、峰2和峰3对PAL和POD两种防卫反应都有一定的诱导活性,其中F1的诱导活性最强,分别是IWF165原液对这两种防卫反应相对诱导活性的129.54%和135.01%。对于小麦悬浮细胞PCD的诱导活性表明:F1对于PCD诱导活性最强,是IWF165原液对PCD相对诱导活性的134.78%,F2的相对诱导活性为30.43%,F3不具备PCD诱导活性。因此进一步的分离纯化以F1为重点展开。 IWF165凝胶过滤层析洗脱峰F1经DEAE—纤维素离子交换柱层析后分离出两个洗脱峰:峰1（LF1）和峰2（LF2）。它们对于PAL和POD都表现出一定的诱导效应,其中LF1的诱导活性明显高于LF2,但两者都低于IWF165原液的诱导活性。对于小麦悬浮细胞PCD的诱导活性,LF1具有较强的诱导活性,而LF2处理的悬浮细胞中未发现PCD细胞,表明诱发细胞产生PCD的激发子位于LF1中。经SDS—PAGE电泳分析表明:LF1洗脱峰电泳谱带在30kD附近有一条泳带,而LF2的电泳谱带表明在20kD和14kD附近各有一条泳带。将LF1中的电泳纯蛋白质进行了肽指纹图谱分析,并由此进一步

论文目录

• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物与真菌
• 2.2 细胞间隙液的制备
• 2.3 洛夫林10小麦悬浮系的建立
• 2.4 小麦叶锈菌芽管研磨液和水培液的制备
• 2.5 激发子活性跟踪
• 2.5.1 注射小麦叶片测定酶活
• 2.5.2 处理小麦悬浮细胞进行形态学观察和DNA分析
• 165中激发子的分离纯化'>2.6 IWF₁₆₅中激发子的分离纯化
• 2.6.1 IWF的分级沉淀
• 2.6.2 凝胶过滤柱层析
• 2.6.3 等电聚焦电泳
• 2.6.4 离子交换柱层析
• 2.6.5 SDS-PAGE电泳
• 2.7 肽指纹图谱分析
• 3 结果与分析
• 3.1 叶锈菌萌发滤液及萌发芽管的研磨液中可能不具备激发子活性
• 3.1.1 叶锈菌萌发状态的观察
• 3.1.2 萌发的叶锈菌研磨液和水培液中激发子活性的检验
• 165中激发子活性的验证'>3.2 IWF₁₆₅中激发子活性的验证
• 165对小麦叶片PAL和POD的诱导'>3.2.1 IWF₁₆₅对小麦叶片PAL和POD的诱导
• 165对小麦悬浮细胞程序性死亡的诱导'>3.2.2 IWF₁₆₅对小麦悬浮细胞程序性死亡的诱导
• 165中激发子的纯化'>3.3 IWF₁₆₅中激发子的纯化
• 165分级沉淀后的活性分布'>3.3.1 IWF₁₆₅分级沉淀后的活性分布
• 165经凝胶过滤柱层析后活性成分的分离'>3.3.2 IWF₁₆₅经凝胶过滤柱层析后活性成分的分离
• 3.3.3 等电聚焦电泳分析凝胶柱层析峰1
• 3.3.4 F1的离子交换柱层析分离分析
• 3.3.5 SDS-PAGE电泳分析
• 3.4 LF1中蛋白质电泳纯的肽指纹图谱分析
• 4 讨论
• 4.1 叶锈菌小种165夏孢子萌发芽管的研磨液及其水培液中可能不存在激发子活性物质
• 4.2 激发子对小麦悬浮细胞PCD的诱导
• 165中激发子的初步定性分析'>4.3 IWF₁₆₅中激发子的初步定性分析
• 165激发子纯化过程中不同组分表现诱导活性各异的原因'>4.4 IWF₁₆₅激发子纯化过程中不同组分表现诱导活性各异的原因
• 165经凝胶过滤柱层析后各峰洗脱液诱导活性分析'>4.4.1 IWF₁₆₅经凝胶过滤柱层析后各峰洗脱液诱导活性分析
• 165经离子交换柱层析后各峰液诱导活性分析'>4.4.2 IWF₁₆₅经离子交换柱层析后各峰液诱导活性分析
• 4.5 激发子的电泳纯结果
• 165中激发子来源的分析'>4.6 IWF₁₆₅中激发子来源的分析
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢