论文摘要
背景与目的：EB病毒（EBV）与鼻咽癌（NPC）的发生发展密切相关，在各种不同类型的NPC组织中均已检测到EBV基因及其表达产物，其中EBV潜伏膜蛋白1（LMPI）被公认为病毒基因组编码的唯一具有促细胞转化作用的瘤蛋白，在NPC发生过程中可能发挥重要作用。研究表明，LMP1羧基末端的三个功能活化区（CTAR1、CTAR2和CTAR3）介导复杂的信号通路，其中CTAR2（TRADD结合区）对LMP1介导的细胞转化、成瘤极为重要。但LMP1促进上皮细胞转化、成瘤的分子机制缺乏系统完整的证据支持。为了全面了解、验证LMP1介导的信号通路，阐述其CTAR2在LMP1促鼻咽上皮细胞转化成瘤中所涉及的网络分子，本研究拟采用蛋白质组学方法分离和鉴定LMP1转化的鼻咽上皮细胞的差异蛋白，为EB病毒在鼻咽癌发生发展中的作用提供进一步证据。方法：采用脂质体转染法将pLNSX-LMP1WT与pLNSX-LMP1TRADD分别导入PA317包装细胞（以pLNSX为对照），G418筛选2周后扩大培养，自细胞培养上清获得后续实验所需的感染性逆病毒RV-LNSX、RV-LMP1WT和RV-LMP1TRADD。然后，用浓缩的病毒分别感染人鼻咽上皮细胞NP69，G418筛选后，汇合克隆培养，获得NP69-LNSX、NP69-LMP1WT和NP69-LMP1TRADD3种转化细胞系。观察和检测以上转化细胞的形态、生长曲线、平板克隆、软琼脂生长能力、细胞周期和抗凋亡能力。采用双向凝胶电泳技术（2—DE）分离这三组细胞的总蛋白，建立了重复性和分辨率均较好的2—DE图谱。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及数据库查询鉴定差异表达蛋白质。部分差异蛋白质应用Real-time quantitative RT-PCR及Western blot方法进行了验证。结果：（1）NP69-LMP1WT细胞在培养过程中，逐渐由多角形、鹅卵石样典型上皮形态逐渐演变成细胞间接触减少的长梭状纤维细胞样形态，细胞间接触明显减少，而NP69-LMP1TRADD细胞呈近乎多角形的形态，细胞间接触较为紧密；NP69-LMP1WT细胞的生长速度、软琼脂集落形成能力、S期细胞所占比例以及抗凋亡能力比NP69-LMP1TRADD及载体对照组NP69-LNSX细胞明显增加；（2）在NPB9-LNSX与NP69-LMP1WT细胞比较组鉴定了21种差异表达的蛋白质，在NP69-LMP1WT与NP69-LMP1TRADD细胞比较组鉴定了18种差异表达的蛋白质，其中大部分是与细胞结构、代谢和转录翻译相关的蛋白；（3）Real-time RT-PCR验证了6种蛋白在转化细胞转录水平的差异，Western blot验证了2种蛋白在转化细胞蛋白表达水平的差异，结果与蛋白质组学结果一致。结论：（1）LMPl可以致人鼻咽上皮细胞NP69获得形态转变、生长增殖加快、软琼脂集落形成能力增强、凋亡抗性增加等恶性表型；（2）LMP1可能通过上调钙网织蛋白、波形蛋白和核纤层蛋白A╱C等，下调角蛋白5、角蛋白19、膜联蛋白Ⅱ等促进NP69细胞转化；（3）LMP1TRADD结合区是LMP1转化致瘤过程中关键功能活化区，通过参与角蛋白19、膜联蛋白Ⅱ、钙网织蛋白、波形蛋白、核纤层蛋白A╱C等多种蛋白表达调节过程参与NP69细胞转化。