hTERT I540-PTD融合基因疫苗诱发抗肿瘤免疫力的实验研究

论文摘要

研究背景 蛋白转导技术是指利用蛋白转导作用域将与之共价结合的化合物、肽、反义肽核酸或与之融合表达的全长蛋白质通过非受体依赖、非转运蛋白依赖方式运送至细胞内的一种技术。蛋白转导作用不是通过全长蛋白发生的,而是依赖于长约10～16个氨基酸残基的富含碱性氨基酸残基的在生理pH值条件下带净正电荷的氨基酸序列,该序列即被称为蛋白转导作用域。最近研究表明蛋白转导技术不仅可显著提高药物进入细胞的效率,而且可作为肿瘤基因治疗的辅助手段来提高对肿瘤组织的杀伤效率,更被用来引导特定抗原进入MHCI类分子依赖的抗原提呈途径并能显著增强肿瘤多肽疫苗和基因疫苗的免疫效能,然而目前尚无研究阐明蛋白转导功能域的转导能力与其对基因疫苗免疫效能的增强能力之间的相互关系。 目的 自行设计并制备重组腺病毒介导的、针对hTERT I540表位的基因疫苗并对其体外加载树突状细胞后诱发抗肿瘤免疫的能力进行评价,比较具有不同蛋白转导能力的蛋白转导功能域对诱发抗肿瘤免疫力的影响。 方法和结果 1、根据hTERT I540表位、HIV-1 TAT-PTD和人工合成的PTD4的氨基酸序列,设计1540-PTD和1540-PTD4并根据人类偏爱密码子反翻译（back-translation）为基因序列,掺入kozak序列,获得真核表达读框。设计6条寡聚脱氧核糖核苷酸链,经磷酸化、退火并连接后克隆至pSP72载体,获得pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4。双酶切鉴定和DNA测序均证实成功获得1540-PTD和I540-PTD4真核表达读框。 2、将I540-PTD和I540-PTD4真核表达读框亚克隆至穿梭质粒pDC315,经双

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.树突状细胞疫苗的现状
• 1.1 树突状细胞的组成
• 1.2 树突状细胞的起源和分类
• 1.3 树突状细胞的生物学特性
• 1.4 树突状细胞的获取和培养
• 1.5 树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用
• 2.人端粒酶逆转录酶的研究现状
• 3.蛋白转导技术
• 4.思路
• 正文
• 第一章 hTERT I540-PTD融合基因表达框的设计和构建
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 仪器设备
• 1.1.3 重要试剂的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 I540-PTD和I540-PTD4融合基因的设计
• 1.2.2 I540-PTD和I540-PTD4融合基因的拼接
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 I540-PTD和I540-PTD的氨基酸序列和核苷酸序列
• 1.3.2 pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4的测序结果
• 1.3.3 pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4质粒图谱
• 1.4 讨论
• 第二章 携带hTERT I540-PTD表达框的重组腺病毒的构建和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 携带I540-PTD和I540-PTD4表达框的穿梭质粒构建
• 2.2.2 复制缺陷型重组腺病毒的制备
• 2.2.3 复制缺陷型重组腺病毒的扩增
• 2.2.4 复制缺陷型重组腺病毒的纯化
• 2.2.5 复制缺陷型重组腺病毒滴度测定
• 2.2.6 复制缺陷型重组腺病毒的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4的酶切鉴定结果
• 2.3.2 pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4质粒图谱
• 2.3.3 HEK293的细胞病变反应
• 2.3.4 Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4病毒滴度的测定
• 2.3.5 Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4的PCR鉴定
• 2.3.6 Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4的表达鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 基于Cre-LoxP系统的重组复制缺陷型腺病毒的制备方法
• 2.4.2 重组腺病毒的滴度测定
• 2.4.3 基因疫苗的优越性
• 2.4.4 影响基因疫苗免疫效能的因素
• 第三章 Ad-I540-PTD体外诱发抗肿瘤免疫能力的测定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 重要试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 人外周血定向诱导分化和培养树突状细胞
• 3.2.2 树突状细胞的转染
• 3.2.3 DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞CTL
• 3.2.4 TNF-α释放试验
• 51释放实验'>3.2.5 Cr⁵1释放实验
• 3.2.6 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 树突状细胞的形态学观察
• 3.3.2 转染后树突状细胞刺激自体淋巴细胞增殖能力的测定
• 3.3.3 TNF-α释放试验
• 51释放实验'>3.3.4 Cr⁵¹释放实验
• 3.4 讨论
• 3.4.1 基因疫苗的接种方式
• 3.4.2 CTL活性的测定方法
• 3.4.3 使用树突状细胞获得高效抗肿瘤免疫力
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 文献综述
• 蛋白转导功能域的研究现状及应用
• 1.蛋白转导技术和蛋白转导功能域
• 1.1 HIV-1 TAT
• 1.2 HSV VP22
• 1.3 果蝇触角足蛋白转导功能域（pANTP-PTD）
• 1.4 人工合成的具有蛋白转导活性的肽
• 2.蛋白转导技术在肿瘤基因治疗中的应用
• 2.1 酶解前体药策略
• 2.2 p53基因治疗
• 3.蛋白转导功能域在肿瘤疫苗领域的应用
• 3.1 HIV-1 TAT-PTD
• 3.2 HSV-1 VP22
• 3.3 pANTP-PTD
• 4.参考文献
• 附录
• 成果
• 致谢