蛋清溶菌酶稀释复性过程中集聚体和中间态的研究

论文摘要

本文以溶菌酶为模型蛋白研究了蛋白质的复性机理。用荧光相图法研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程的中间态,用阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高效凝胶排阻层析法（SEC）研究了蛋清溶菌酶稀释复性过程形成的集聚体。本研究结果为探索蛋白质折叠机理提供了有益的帮助。 在用荧光相图法研究脲和盐酸胍诱导去折叠蛋清溶菌酶的折叠过程中发现:当去折叠体系中有还原剂β-巯基乙醇时,还原变性溶菌酶的稀释复性过程中都没有中间态产生,符合典型的“二态模型”;当去折叠体系中没有还原剂存在时,变性溶菌酶的稀释复性过程中都会产生两个中间态,符合“四态模型”。 当用复性缓冲液稀释还原脲变性溶菌酶时,会迅速产生可观量的沉淀。上清液和沉淀的非还原SDS-PAGE结果表明还原脲变性溶菌酶除了能直接复性成天然态溶菌酶分子外,还能在上清液中形成溶菌酶分子三聚体,同时在沉淀中形成溶菌酶分子二聚体。上清液的SEC分析结果也验证了上清液中含有溶菌酶分子三聚体。上清液和沉淀的还原SDS-PAGE结果表明,二聚体和三聚体主要是还原脲变性溶菌酶分子通过分子间二硫键错配形成的。同时沉淀的阴极PAGE电泳和在复性过程中加入SDS的复性结果表明复性过程中形成的二聚体是可溶的,可溶的溶菌酶分子二聚体之间通过非共价键相互作用形成了溶菌酶分子四聚体沉淀。 非还原脲变性溶菌酶稀释复性液的非还原SDS-PAGE结果表明当溶菌酶浓度小于7.0mg/mL时,复性过程中不会形成集聚体;而当溶菌酶浓度大于7.0mg/mL时,复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。复性液的阴极PAGE表明,当溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时,复性过程中不会形成集聚体;而当溶菌酶浓度大于4.0mg/mL时,复性过程中会形成溶菌酶分子二聚体和三聚体。同时,复性液的SEC结果也证实了非还原脲变性蛋清溶菌酶在复性过程中产生了溶菌酶分子二聚体和三聚体。 综合以上实验结果可以得出以下结论:（Ⅰ）还原脲和盐酸胍变性溶菌酶的稀释复性过程中没有中间态产生,它们的复性过程均为“二态过程”。还原脲变性

论文目录

• 摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 蛋白质折叠的研究进展
• 1.1 蛋白折叠理论的介绍
• 1.2 蛋白质折叠的热力学研究和动力学研究
• 1.3 蛋白质多肤链的折叠模型
• 1.3.1 成核-生长模型
• 1.3.2 扩散-碰撞-缔合模型
• 1.3.3 框架模型
• 1.3.4 疏水坍缩模型
• 1.3.5 拼图模型
• 1.3.6 动力学模型
• 2 溶菌酶
• 3 蛋白质折叠过程中间态的研究
• 4 蛋白质复性过程中集聚体的研究进展
• 5 本课题的研究目的、意义及研究内容
• 5.1 本课题的研究目的和意义
• 5.2 本课题的研究内容
• 第二部分 材料和方法
• 1 主要试剂与仪器
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 荧光像图
• 2.1.1 实验原理
• 2.1.2 试剂配制
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 溶菌酶变性
• 2.2.1 溶菌酶的还原脲变性过程
• 2.2.2 溶菌酶的非还原脲变性过程
• 2.3 溶菌酶的复性
• 2.3.1 还原脲变性溶菌酶的稀释复性过程
• 2.3.2 非还原脲变性溶菌酶的稀释复性过程
• 2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.1 试液的配置
• 2.4.2 样品的处理
• 2.4.3 SDS-PAGE电泳条件
• 2.5 阴极聚丙烯酰胺电泳
• 2.5.1 试液的配置
• 2.5.2 制胶
• 2.5.3 电泳条件
• 2.6 蛋白浓度分析
• 2.7 溶菌酶活性的测定-E.I.P法
• 2.8 高效凝胶排阻层析
• 第三章 用荧光相图法研究蛋清溶菌酶的稀释复性过程
• 1 脲变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 1.1 还原脲变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 1.2 非还原脲变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 2 盐酸胍变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 2.1 非还原盐酸胍变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 2.2 还原盐酸胍变性溶菌酶稀释复性荧光相图
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 脲变性溶菌酶稀释复性过程中集聚体的研究
• 1 还原脲变性溶菌酶稀释复性集聚体的研究
• 1.1 还原变性溶菌酶稀释复性过程沉淀和上清液的非还原 SDS-PAGE
• 1.2 还原变性溶菌酶复性上清液的高效凝胶排阻色谱
• 1.3 还原变性溶菌酶复性液沉淀和上清的还原 SDS-PAGE
• 1.4 在SDS存在下还原脲变性溶菌酶的稀释复性
• 1.5 还原脲变性溶菌酶稀释复性液沉淀的阴极聚丙烯酞胺电泳
• 2 非还原脲变性溶菌酶稀释复性集聚体的研究
• 2.1 非还原脲变性溶菌酶稀释复性液的SDS-PAGE
• 2.2 非还原脲变性溶菌酶稀释复性液的阴极 PAGE
• 2.3 非还原变性溶菌酶复性液的凝胶排阻色谱
• 2.4 非还原脲变性溶菌酶稀释复性机理
• 第五章 结论
• 1 结论
• 2 本实验展望
• 第六章 参考文献
• 致谢